테스트 샘플에서 젖산의 정량화를 위한 비색 분석

초록

출처: Yanase, S., et al. 선충 Caenorhabditis elegans에서 세포 내 젖산 및 피루브산의 소규모 비색 분석. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 젖산 탈수소효소를 사용하여 세포 용해물에서 젖산을 측정하기 위한 비색 분석에 대해 설명합니다. 이 효소는 젖산을 피루브산으로 변환하고, NAD를 테트라졸륨 염료와 반응하는 NADH로 변환하여 젖산을 정량화하기 위해 분광 광도계로 측정할 수 있는 착색 제품을 제공합니다.

프로토콜

1. 예쁜꼬마선충의 동기화된 문화

1. 파종하기 전에 Escherichia coli(E. coli) 균주 OP50을 300mL의 Luria-Bertani(LB) 육수 액체 배지에서 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양된 OP50을 -4°C에서 보관하십시오.
   1. LB 육수 액체 매체를 만들려면 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 10g, 1N NaOH 1.5mL를 사용하고 탈이온수로 1L를 추가합니다. 오토클레이브.
      메모: OP50 및 C. elegans 균주는 Caenorhabditis Genetics Center(미국 미네소타주 세인트폴 소재 미네소타 대학교)에서 구할 수 있습니다.
2. 선충 성장 배지(NGM) 한천을 만들려면 NaCl 3g, 펩톤 2.5g, 한천 17g, 탈이온수 975mL를 사용합니다. 오토 클레이 브. 55°C로 냉각한 다음 1M MgSO₄ 1mL, 1M CaCl₂ 1mL, EtOH에 5mg/mL 콜레스테롤 1mL, 90mm 페트리 접시에 pH 6.0 1M 인산칼륨 25mL를 차례로 멸균 첨가합니다.
   1. pH 6.0 1M 인산칼륨의 경우 108.3g의 KH₂PO₄ 및 46.6g의 K₂HPO₄를 사용하고 1L. 오토클레이브에 탈이온수를 추가합니다.
3. 배양된 OP50 1-2mL를 NGM 한천 플레이트에 펴 바릅니다. OP50의 얇은 층을 만들려면 선충을 추가하기 전에 실온에서 밤새 플레이트를 배양하십시오.
   메모: OP50을 접종한 NGM 한천 플레이트는 실온에서 2-3주 동안 보관할 수 있습니다.
4. OP50을 사용하여 NGM 한천 플레이트에 최소 100마리의 벌레를 추가하고 성체 단계까지 20°C에서 배양합니다. 최소 3개의 플레이트가 필요합니다.
5. 자궁에서 난자를 채취하려면 15mL 원뿔형 튜브에 각각 5mL의 S 완충액이 있는 3개의 NGM 한천 플레이트에서 중력 자웅동체를 옮기고 실온에서 30초 동안 300 x g의 원심분리를 사용하여 15mL의 S 완충액으로 벌레를 3회 세척합니다.
   1. S 완충액을 만들려면 NaCl 5.9g과 pH 6.0 1M 인산칼륨 50mL를 사용하고 탈이온수로 1L에 첨가합니다. 오토 클레이 브.
6. 축삭 화 및 벌크 계란 분리를 위해 알칼리성 차아염소산염 용액(신선한 표백제 0.5mL 또는 이에 상응하는 것: 5-6% 차아염소산나트륨, 10M NaOH 0.1mL, S 완충액 약 4.5mL)에 웜을 용해시키고 실온에서 10-15분 동안 용액을 뒤집어 혼합하여 방치합니다.
   메모: 15분 이내에 성충은 용해되어 사체에서 해방된 흐릿한 알 용액을 남겨야 합니다(방출된 알은 실체 현미경을 사용하여 확인해야 함). 0.1 mL의 10 N NaOH 대신에, 0.2 mL의 5 N NaOH도 사용될 수 있다.
7. 차아염소산염 처리 후 난자를 15mL의 S 완충액으로 3회 세척하고 5-6mL의 S 완충액에 재현탁합니다. 방출된 알을 20°C에서 하룻밤 부화하는 동안 E. coli가 없는 S 완충액에서 L1 단계 유충의 연령 동기 배양을 위해 부화합니다.
8. L1 단계 유충의 대략적인 수를 결정하려면 유충을 3회 이상 재현탁시킨 후 10μL의 S 버퍼에서 실체 현미경을 사용하여 벌레를 세고 평균을 계산합니다. 그런 다음 L1 단계 유충을 OP50(90mm 페트리 접시를 사용하여 플레이트당 1,500-3,000마리의 벌레)을 사용하여 5개의 NGM 한천 플레이트로 옮기고 자가 수정이 시작되고 몇 개의 알을 낳는 젊은 성인 단계까지 자랄 때까지(보통 3일 후) 20°C에서 배양합니다.

2. 예쁜꼬마선충에서 세포 분획 추출

1. S 완충액이 있는 5개의 NGM 한천 플레이트에서 어린 성체 단계(5일 된 동물) 기생이를 수집합니다(그림 1A).
   1. 30%(w/v) 자당에 대한 부유선광을 위해 자당 방법 6을 사용하여 살아있는 벌레만 선택하려면 3-4mL의 S 완충액에 현탁된 벌레를 15mL 원뿔형 튜브에서 동일한 부피의 얼음처럼 차가운 60%(w/v) 자당과 혼합합니다. 튜브를 1,500 x g에서 4 °C에서 15초 동안 돌리고 파스퇴르 피펫으로 튜브 벽에서 제거하여 떠 있는 벌레를 새 튜브로 제거합니다.
2. 4°C에서 30초 동안 1,500 x g에서 원심분리하여 S 버퍼로 벌레를 3회 세척합니다. 1,000μL 마이크로피펫 팁을 사용하여 원심분리 후 세척된 벌레의 습윤량을 확인합니다(그림 1B).
3. 세척된 벌레를 단백질 침전을 위해 동일한 부피의 얼음처럼 차가운 10%(w/v) 트리클로로아세트산(TCA, 최종 농도 5%)에 추가합니다(그림 1C). TCA 대신 과염소산(PCA) 또는 메타인산을 사용할 수 있습니다.
4. 얼음 위에서 최대 1,300rpm으로 회전하면서 테프론 균질화기(Potter-Elvehjem 조직 분쇄기)에서 절굿공이를 40번 스트로크하여 침전제로 벌레를 균질화합니다.
5. 파스퇴르 피펫을 사용하여 균질액을 새로운 1.5mL 마이크로튜브로 옮기고 얼음에서 20% 듀티 사이클로 3분(1분의 3회) 동안 초음파 처리합니다.
6. 4°C에서 10분 동안 8,000 x g에서 원심분리로 균질액을 정화합니다.얼음에서 20분 동안 4 M KOH(0.25 부피 - 10% TCA)로 상층액을 중화하고 4 °C에서 10분 동안 8,000 x g에서 원심분리합니다. 상등액(테스트 샘플)은 다음 분석이 수행될 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다.

3. 비색 분석 키트를 사용한 젖산 분석

1. 비색 분석 키트(Table of Materials)를 사용하여 테스트 샘플의 젖산 농도를 측정합니다. 테스트 샘플에 대한 이중 검사를 수행합니다. 5 또는 10 μL의 테스트 샘플을 96-well 플레이트에 추가하고 키트와 함께 제공된 Lactate Assay Buffer를 사용하여 well당 50 μL로 부피를 조정합니다.
2. 젖산 표준물질 곡선의 경우 젖산 분석 버퍼를 사용하여 100mM L(+)-젖산 표준물질을 1mM로 희석합니다. 키트와 함께 제공되는 1mM L(+)-젖산 표준물질의 0, 2, 4, 6, 8 및 10 μL를 일련의 웰에 추가합니다.
3. 50 μL의 반응 혼합물(무수 DMSO의 젖산 분석 완충액, 젖산 효소 혼합물 및 젖산 프로브 46:2 함유, 모든 시약은 키트와 함께 제공됨) 또는 백그라운드 컨트롤 혼합물(젖산 분석 완충액 및 젖산 프로브 48:2 포함)을 각 웰에 추가하고 샘플이 빛으로부터 보호되는 동안 30-60분 동안 실온에서 배양합니다.
4. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하고 반응 혼합물의 흡광도에서 Background Control Mix의 흡광도를 뺍니다.
5. 젖산 표준 곡선을 플로팅합니다. 젖산 표준 곡선에서 테스트 샘플의 젖산 농도를 계산합니다.

결과

그림 1. 세포 대사 산물의 추출을 위한 과정. (A) 1,500-3,000마리의 지렁이를 NGM 한천 플레이트(90mm 페트리 접시)에 놓았습니다. 5개의 플레이트에 있는 벌레에서 추출하는 것은 비색 분석에 충분했습니다. (B) 판당 3,000마리와 1,500마리의 5개 판에서 채취한 지렁이는 패널의 왼쪽과 오른쪽에 각각 표시되어 있습니다. 각 15mL 튜브의 습식 부피는 모두 0.5mL로 검출하기에 충분<. (C) 웜의 균질화 중 10% TCA를 사용한 단백질 침전. 균질화기에서 얼음처럼 차가운 10% TCA에 벌레를 추가하는 것은 벌레가 균질화되기 전에 수행해야 합니다. 그렇지 않으면 비색...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay 키트	바이오비전	#K607-100	비색 / 형광 100 분석; -20oC에서 보관하십시오.
트리클로로아세트산	와코 퓨어 케미칼	#의 207-04955	실온에서 보관
테프론 균질화기	이와키/파이렉스	#358034 (휘튼)	Wheaton에서 사용할 수 있는 Iwaki/Pyrex 대신