웜의 세포 분획에서 피루브산 수치 추정을 위한 피루브산 분석

초록

출처: Yanase, S. et al. 선충 Caenorhabditis elegans에서 세포 내 젖산 및 피루브산의 소규모 비색 분석.J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 Caenorhabditis elegans의 세포 분획에서 피루브산을 정량적으로 측정하기 위한 비색 분석을 설명합니다. 피루브산 산화효소와 세포 피루브산의 효소 반응에서 생성된 과산화수소를 활용하여 발색 염료를 산화시켜 유색 제품을 생성하고, 피루브산 농도를 결정하기 위해 비색계를 사용하여 측정합니다.

프로토콜

1. 예쁜꼬마선충의 동기화된 문화

1. 파종하기 전에 Escherichia coli(E. coli) 균주 OP50을 300mL의 Luria-Bertani(LB) 육수 액체 배지에서 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양된 OP50을 -4°C에서 보관하십시오.
   1. LB 육수 액체 매체를 만들려면 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 10g, 1N NaOH 1.5mL를 사용하고 탈이온수로 1L를 추가합니다. 오토클레이브.
      메모: OP50 및 C. elegans 균주는 Caenorhabditis Genetics Center(미국 미네소타주 세인트폴 소재 미네소타 대학교)에서 구할 수 있습니다.
2. 선충 성장 배지(NGM) 한천을 만들려면 NaCl 3g, 펩톤 2.5g, 한천 17g, 탈이온수 975mL를 사용합니다. 오토 클레이 브. 55°C로 냉각한 다음 1M MgSO₄ 1mL, 1M CaCl₂ 1mL, EtOH에 5mg/mL 콜레스테롤 1mL, 90mm 페트리 접시에 pH 6.0 1M 인산칼륨 25mL를 차례로 멸균 첨가합니다.
   1. pH 6.0 1....

결과

그림 1. 세포 대사 산물의 추출을 위한 과정. (A) 1,500-3,000마리의 지렁이를 NGM 한천 플레이트(90mm 페트리 접시)에 놓았습니다. 5개의 플레이트에 있는 벌레에서 추출하는 것은 비색 분석에 충분했습니다. (B) 판당 3,000마리와 1,500마리의 5개 판에서 채취한 지렁이는 패널의 왼쪽과 오른쪽에 각각 표시되어 있습니다. 각 15mL 튜브의 습식 부피는 모두 0.5mL로 검출하기에 충분<. (C) 웜의 균질화 중 10% TCA를 사용한 단백질 침전. 균질화기에서 얼음처럼 차가운 10% TCA에 벌레를 추가하는 것은 벌레가 균질화되기 전에 수행해야 합니다. 그렇지 않으면 비색 분석 키트를 사용하는 테스트 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
EnzyChrom 피루브산 분석 키트	BioAssay 시스템	#EPYR-100	비색 / 형광 100 분석법; -20°C에서 보관하십시오
트리클로로아세트산	와코 퓨어 케미칼	#의 207-04955	실온에서 보관
테프론 균질화기	이와키/파이렉스	#358034 (휘튼)	이와키/파이렉스 대신 Wheaton에서 사용 가능