글리코겐 합성효소 활성을 결정하기 위한 분광광도계 분석

초록

출처: Wilson W.A., 진핵생물 글리코겐 대사 연구를 위한 분광광도법. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 글리코겐 합성효소 활성을 추정하기 위한 분광광도계 분석을 설명합니다. 이 방법은 시간이 지남에 따라 NADH의 흡수율 감소에 의존하며 글리코겐 합성효소 활성을 나타냅니다.

프로토콜

1. 글리코겐 합성효소 활성의 결정

1. 표 1(실험일 이전)에 표시된 대로 필요한 시약의 원액을 준비합니다.
2. 분석 당일, 4.5 mg의 NADH를 1.5 mL의 50 mM Tris-HCl, pH 8.0에 용해시켜 4 mM NADH의 새로운 작업 용액을 준비합니다. 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오.
3. UDP-포도당, ATP, 포스포에노피루베이트 및 NDP 키나아제의 원액을 얼음에서 해동합니다.
4. 수조를 30°C로 예열합니다.
5. 표 2.
   에 나열된 반응 혼합물 시약을 추가하여 1.5mL 튜브에 각 글리코겐 합성효소 분석을 설정합니다. 메모: 설정을 용이하게 하기 위해 계획된 분석 수를 완료하기 위해 위에 나열된 각 시약을 충분히 포함하는 마스터 믹스를 만들 수 있습니다.
6. 위의 혼합물에서 NADH가 물로 대체되는 블랭크 반응을 준비합니다. 일회용 메타크릴레이트 큐벳으로 옮기고 이를 사용하여 분광 광도계의 영점을 340nm로 설정합니다.
7. 1.5 mL 튜브에 770 μL의 반응 분취액 혼합물 1개를 섭취합니다. NDP 키나아제 2 μL와 피루브산 키나아제/젖산 탈수소효소 혼합물 2 μL를 첨가하고 부드럽게 혼합한 후 30°C에서 3분 동안 배양하여 반응 혼합물을 예열합니다.
8. 20mM Tris 완충액, pH 7.8에 글리코겐 합성효소를 함유한 시료 30μL를 첨가하고, 반응 혼합물을 일회용 메타크릴레이트 큐벳에 옮기십시오.
9. 큐벳을 분광 광도계에 놓고 10-20분 동안 일정 간격으로 340nm에서 흡광도를 기록합니다. 시간에 대해 얻은 흡광도를 플롯합니다.
   메모: 글리코겐 합성효소 시료를 20mM Tris 완충액으로 대체하는 반응을 수행하여 NADH의 비효소 산화를 제어해야 합니다. 샘플의 순도에 따라 다른 대조 반응이 필요할 수 있습니다.
10. 반응 속도를 결정합니다.

표 1: 글리코겐 합성효소 활성의 분석에 필요한 원액.

호

구성 요소	사용법
50mM 트리스 pH 8.0	0.61g의 Tris 염기를 ~ 80mL의 물에 녹입니다. 4 °C로 식히십시오. HCl로 pH를 8.0으로 조정하고 물로 부피를 최대 100mL로 만듭니다.
20mM HEPES 버퍼	0.477g의 HEPES를 ~ 80mL의 물에 녹입니다. NaOH로 pH를 7.0으로 조정하고 물로 100mL로 부피를 구성합니다.
132mM 트리스/32mM KCl 완충액 pH 7.8	~90mL의 물에 트리스 염기 1.94g과 KCl 0.239g을 용해합니다. HCl로 pH를 7.8로 조정하고 물로 100mL로 부피를 구성합니다.
0.8% w/v 굴 글리코겐	굴 글리코겐 80mg의 무게를 달아 물에 넣으십시오. 최종 부피를 물로 최대 10mL까지 만들고 부드럽게 데우거나 섞어 글리코겐을 완전히 녹입니다.
100mM UDP-포도당	0.31g의 UDP-포도당을 물에 녹이고 최종 부피를 최대 1mL로 만듭니다. -20 °C에서 냉동 한 부분 표본에 보관하십시오. 몇 달 동안 안정적입니다.
50 mM ATP	0.414g의 ATP를 ~ 13mL의 물에 녹입니다. NaOH로 pH를 7.5로 조정하고 물로 15mL로 부피를 구성합니다. -20 °C에서 냉동 한 부분 표본에 보관하십시오. 몇 달 동안 안정적입니다.
100mM 포도당-6-인산염 pH 7.8	0.282g의 포도당-6-인산염을 ~ 7-8mL의 물에 녹입니다. NaOH로 pH를 7.8로 조정하십시오. 물로 최대 10mL의 부피를 만드십시오. -20 °C의 분취량에 냉동 보관합니다. 최소 6개월 동안 안정적입니다.
40 mM 포스포에놀피루베이트	4mg의 포스포에놀피루베이트를 20mM HEPES 완충액 pH 7.0 0.5mL에 용해시킵니다. -20 °C에서 보관하십시오. 최소 1주일 동안 안정적입니다.
0.5 M mnCl2	100mL 물의 최종 부피에 9.90g의 MnCl2를 용해시킵니다.
NDP 키나아제	동결건조된 분말을 1U/μl 용액을 주기에 충분한 물로 재구성합니다. 부분 표본을 준비하고 액체 질소에 동결하고 -80 °C에서 보관하십시오. 최소 1 년 동안 안정적입니다.

표 2: 글리코겐 합성효소 활성의 분석을 위한 조성 반응 혼합물.

명 의 분 의 의 의 분 분 호 의

구성 요소	부피 (μl)
160mM 트리스/32mM KCl 완충액 pH 7.8	250
물	179
100mM 포도당-6-인산염, pH 7.8	58
0.8 % 굴 글리코겐 w / v	67
50 mM ATP	80
4mM NADH	80
100mM UDP-포도당	28
40mM 포스포에놀피루베이트	20
0.5 M mnCl2	8
최종 볼륨	770

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
밀랍 옥수수에서 추출한 Amylopectin (아밀로스 없음)	피셔 사이언티픽	A0456
아밀로스	바이오 신스Carbosynth	YA10257
ATP, 다이소듐 염	밀리포어시그마	A3377 (영어
D-글루코스-1,6-비스포스페이트, 칼륨염	밀리포어시그마	G6893
D-포도당-6-인산염, 나트륨 염	밀리포어시그마	G7879 (영문
효모에서 추출한 포도당-6-인산 탈수소효소, 등급 I	밀리포어시그마	10127655001
글리코겐, 굴에서 추출한 II형	밀리포어시그마	G8751
헥소키나제	밀리포어시그마	11426362001
메타크릴레이트 큐벳, 1.5mL	피셔 사이언티픽	Tel.: 14-955-128	메타크릴레이트는 일부 절차가 340nm 이하에서 수행되기 때문에 필요합니다
β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산염 나트륨 염	밀리포어시그마	N0505
β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 감소된 디소듐 염	밀리포어시그마	43420
뉴클레오시드 5'-디포스페이트 키나아제	밀리포어시그마	N0379
포스포에노피루베이트, 모노칼륨염	밀리포어시그마	P7127
토끼 근육에서 추출한 포스포글루코무타아제	밀리포어시그마	P3397
토끼 근육에서 추출한 포스포릴라아제 A	밀리포어시그마	P1261
토끼 근육에서 추출한 피루브산 키나아제/젖산 탈수소효소	밀리포어시그마	P0294
UDP-포도당, 디소듐 염	밀리포어시그마	U4625

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