글리코겐 합성효소 활성을 결정하기 위한 분광광도계 분석

초록

출처: Wilson W.A., 진핵생물 글리코겐 대사 연구를 위한 분광광도법. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 글리코겐 합성효소 활성을 추정하기 위한 분광광도계 분석을 설명합니다. 이 방법은 시간이 지남에 따라 NADH의 흡수율 감소에 의존하며 글리코겐 합성효소 활성을 나타냅니다.

프로토콜

1. 글리코겐 합성효소 활성의 결정

1. 표 1(실험일 이전)에 표시된 대로 필요한 시약의 원액을 준비합니다.
2. 분석 당일, 4.5 mg의 NADH를 1.5 mL의 50 mM Tris-HCl, pH 8.0에 용해시켜 4 mM NADH의 새로운 작업 용액을 준비합니다. 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오.
3. UDP-포도당, ATP, 포스포에노피루베이트 및 NDP 키나아제의 원액을 얼음에서 해동합니다.
4. 수조를 30°C로 예열합니다.
5. 표 2.
   에 나열된 반응 혼합물 시약을 추가하여 1.5mL 튜브에 각 글리코겐 합성효소 분석을 설정합니다. 메모: 설정을 용이하게 하기 위해 계획된 분석 수를 완료하기 위해 위에 나열된 각 시약을 충분히 포함하는 마스터 믹스를 만들 수 있습니다.
6. 위의 혼합물에서 NADH가 물로 대체되는 블랭크 반응을 준비합니다. 일회용 메타크릴레이트 큐벳으로 옮기고 이를 사용하여 분광 광도계의 영점을 340nm로 설정합니다.
7. 1.5 mL 튜브에 770 μL의 반응 분취액 혼합물 1개를 섭취합니다. NDP 키나아제 2 μL와 피루브산 키나아제/젖산 탈수소효소 ....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
밀랍 옥수수에서 추출한 Amylopectin (아밀로스 없음)	피셔 사이언티픽	A0456
아밀로스	바이오 신스Carbosynth	YA10257
ATP, 다이소듐 염	밀리포어시그마	A3377 (영어
D-글루코스-1,6-비스포스페이트, 칼륨염	밀리포어시그마	G6893
D-포도당-6-인산염, 나트륨 염	밀리포어시그마	G7879 (영문
효모에서 추출한 포도당-6-인산 탈수소효소, 등급 I	밀리포어시그마	10127655001
글리코겐, 굴에서 추출한 II형	밀리포어시그마	G8751
헥소키나제	밀리포어시그마	11426362001
메타크릴레이트 큐벳, 1.5mL	피셔 사이언티픽	Tel.: 14-955-128	메타크릴레이트는 일부 절차가 340nm 이하에서 수행되기 때문에 필요합니다
β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산염 나트륨 염	밀리포어시그마	N0505
β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 감소된 디소듐 염	밀리포어시그마	43420
뉴클레오시드 5'-디포스페이트 키나아제	밀리포어시그마	N0379
포스포에노피루베이트, 모노칼륨염	밀리포어시그마	P7127
토끼 근육에서 추출한 포스포글루코무타아제	밀리포어시그마	P3397
토끼 근육에서 추출한 포스포릴라아제 A	밀리포어시그마	P1261
토끼 근육에서 추출한 피루브산 키나아제/젖산 탈수소효소	밀리포어시그마	P0294
UDP-포도당, 디소듐 염	밀리포어시그마	U4625

) ) 【무수정유출】 년 【무려】 (영문) (영문) 효소 (영문)