세포 과정을 실시간으로 모니터링하기 위한 세포 임피던스 기반 분석

초록

출처: Labadie, T., et al., 실시간 세포 분석을 사용하여 숙주 밖에서 인플루엔자 바이러스 생존 모니터링. J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오에서는 세포 임피던스 분석을 통해 부착 세포의 증식을 포함한 세포 이벤트를 실시간으로 모니터링하는 과정을 보여줍니다. 여기서 접착 셀은 절연체 역할을 하여 전극 사이의 전류 흐름을 제한하고 임피던스를 증가시킵니다.

프로토콜

참고: 모든 실험 중에는 포장의 종이 랩과 같이 판을 항상 정전기가 없는 표면에 보관하십시오. 아래 섹션 1에 따라 전자 마이크로타이터 플레이트(E-Plate로 설계됨)에 파종할 세포의 가장 적절한 농도를 결정합니다.

1. 감염 세포에 적합한 세포 수량 결정

1. 실험 24시간 전에 갓 분할된 세포(약 80% 합류)를 얻기 위해 75cm² 플라스크에 MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 세포를 준비합니다.
2. 5mL의 1x PBS로 세포를 세척하고 3mL의 0.25% 트립신-EDTA 용액을 첨가하여 분리합니다.
3. 7mL의 신선한 세포 배양 배지를 추가하고 트리판 블루 염색이 가능한 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
4. 세포 배양 배지를 사용하여 세포 농도를 400,000 cells/mL로 조정합니다. 추가 튜브에서 2배 연속 희석을 수행하여 200,000의 세포 밀도를 얻습니다. 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; 및 6,250 cells/mL. 세포의 종류와 성장 경향에 따라 세포의 희석 범위를 조정한다.
5. E-플레이트(Table of Materials)를 RT에서 몇 분 동안 방치하고 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 100μL의 세포 배양 배지를 추가합니다. E-Plate의 전극을 만지지 마십시오.
6. 크래들의 잠금을 해제하고 플레이트 전면 끝을 임피던스 측정기의 크래들 포켓에 삽입합니다(재료 표). 인큐베이터의 문을 닫습니다.
7. 소프트웨어를 엽니다.
   1. "Default experiment pattern setup(기본 실험 패턴 설정)"에서 선택한 요람을 선택하고 상단 페이지를 두 번 클릭한 다음 실험 이름을 입력합니다. "레이아웃"을 클릭하고 플레이트의 선택한 각 웰에 대해 필요한 샘플 정보를 입력합니다. 그런 다음 완료되면 "적용"을 클릭하십시오. "Schedule(일정)" | "Steps(단계)" | "Add a step(단계 추가)"을 클릭합니다. 소프트웨어는 배경 임피던스(CI)를 측정하기 위해 1초의 단계를 자동으로 추가합니다.
   2. "Execute(실행)" 탭에서 "Start/Continue(시작/계속)"를 클릭합니다. "Plot"을 클릭하고, 적절한 웰을 선택하여 모든 샘플을 추가하고, 다음 단계로 진행하기 전에 CI가 -0.1에서 0.1 사이인지 확인합니다.
8. 크래들에서 플레이트를 제거합니다.
9. 1.4단계에서 중복하여 각 세포 현탁액 100μL를 적절한 웰에 추가하고 대조군으로 사용된 웰에 100μL의 세포 배지를 추가합니다. 웰 바닥에 있는 세포가 균일하게 분포할 수 있도록 RT에서 30분 동안 층류 후드의 E-플레이트를 그대로 둡니다.
10. E-플레이트를 크래들 포켓에 삽입합니다. 소프트웨어에서 "Schedule(일정)" | "Add step(단계 추가)"을 클릭하고 값을 입력하여 30분마다 200회 반복 셀을 모니터링합니다. 그런 다음 "시작/계속"을 선택합니다.
11. 소프트웨어에서 "Plot" 버튼을 클릭하여 CI 데이터를 확인하고 플롯합니다. 바이러스 감염 중에 아직 성장 단계에 있는 세포를 얻기 위해 플레이트에 파종한 후 24시간 후에 고정기 직전에 있는 세포의 농도를 선택합니다. CI가 최대일 때 고정상에 도달합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
E-플레이트 16 (6 플레이트)	ACEA 바이오사이언스, Inc	5469830001	E-플레이트는 다양한 포장으로 제공됩니다.
PBS 1배	생명 기술(gibco)	14040091
TPCK-트립신	워 딩 턴	LS003740
xCELLigence 실시간 세포 분석 기기 S16	ACEA 바이오사이언스, Inc	380601310	xCELLigence RTCA S16 기기는 다양한 형식(16-well, 96-well, 단일 또는 다중 플레이트)으로 제공됩니다.
75 cm2 조직 배양 플라스크	송골매	430641U
MEM 1X	생명 기술(gibco)	31095029