인플루엔자 바이러스 감염의 다양성을 측정하기 위한 임피던스 기반 세포 분석

초록

출처: Labadie, T., et al., 실시간 세포 분석을 사용하여 숙주 밖에서 인플루엔자 바이러스 생존 모니터링. J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오에서는 CIT₅₀과 바이러스 감염의 다양성 사이의 상관 관계에 대해 논의합니다. 바이러스에 감염된 세포는 세포병성 효과를 나타내어 세포를 사멸시키고 금 미세전극에서 분리되어 임피던스를 감소시킵니다.

프로토콜

1. CIT₅₀ 값과 감염 다중성 간의 상관 관계

1. E-플레이트의 각 웰에 100μL의 멸균 1x MEM 배양 배지를 추가합니다. E-플레이트를 35°C에서 기기의 크래들 포켓에 삽입합니다.
2. 설명된 대로 배경을 측정합니다.
3. 소프트웨어를 엽니다.
   1. "Default experiment pattern setup(기본 실험 패턴 설정)"에서 선택한 요람을 선택하고 상단 페이지를 두 번 클릭한 다음 실험 이름을 입력합니다. "레이아웃"을 클릭하고 플레이트의 선택한 각 웰에 대해 필요한 샘플 정보를 입력합니다. 그런 다음 완료되면 "적용"을 클릭하십시오. "Schedule(일정)" | "Steps(단계)" | "Add a step(단계 추가)"을 클릭합니다. 소프트웨어는 배경 임피던스(CI)를 측정하기 위해 자동으로 1s 단계를 추가합니다.
   2. "Execute(실행)" 탭에서 "Start/Continue(시작/계속)"를 클릭합니다. "Plot"을 클릭하고, 적절한 well을 선택하여 모든 샘플을 추가하고, 다음 단계로 진행하기 전에 CI가 -0.1에서 0.1 사이인지 확인합니다.
4. 크래들에서 E-플레이트를 제거합니다.
5. 전자 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 갓 분할된 MDCK 세포 3 x 10⁴를 파딩하고 35°C에서 5% CO₂로 24시간 동안 성장시켜 IAV 감염 중 복제 단계에 있도록 합니다.
6. 아래 단계에 따라 재현성을 위해 역 피펫팅을 사용하여 H1N1 바이러스의 알려진 6log₁₀TCID₅₀/mL 역가를 10배 희석하여 MDCK 세포를 감염시킵니다.
   1. FCS(바이러스 전파 매체)가 없는 100μL의 MEM으로 MDCK 세포를 2x 헹굽니다. 접종물이 더 이상 희석되지 않도록 두 번째 세척 후 모든 매체를 제거하는 것에 주의하십시오.
   2. 단일 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 100μL의 바이러스 현탁액을 추가합니다. 오염을 방지하려면 왼쪽에서 오른쪽으로 시작한 다음 플레이트의 위에서 아래로 진행하면서 나머지 웰을 뚜껑으로 덮습니다.
   3. 35°C에서 기기의 크래들 포켓에 플레이트를 삽입합니다. 잠재적으로 오염으로 이어질 수 있는 갑작스러운 움직임을 피하기 위해 부드럽게 하십시오.
   4. 설명된 대로 최소 100시간 동안 15분마다 셀 임피던스 모니터링을 시작합니다.
      1. E-플레이트를 크래들 포켓에 삽입합니다. 소프트웨어에서 "Schedule(일정)" | "Add step(단계 추가)"을 클릭하고 값을 입력하여 30분마다 200회 반복 셀을 모니터링합니다. 그런 다음 "시작/계속"을 선택합니다.
   5. 두 번의 측정 주기(즉, 30분) 후에 "실행" 탭에서 "일시 중지"를 클릭하여 장치를 일시 중지하고 크래들에서 E-플레이트를 제거합니다.
   6. 바이러스 증식 배지에 1μg/mL TPCK-트립신을 첨가하여 바이러스 헤마글루티닌을 절단합니다.
   7. TPCK-trypsin을 함유한 바이러스 전파 배지 100μL를 각 웰에 추가하고 E-plate를 크래들 포켓에 삽입합니다.
   8. "실행" 탭에서 "시작/계속"을 클릭합니다.
      메모: 바이러스 현탁액을 바이러스 증식 배지로 대체하여 모의 감염 세포에 해당하는 음성 대조군을 만드는 것을 잊지 마십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
E-플레이트 16 (6 플레이트)	ACEA 바이오사이언스, Inc	5469830001	E-플레이트는 다양한 포장으로 제공됩니다.
MEM 1X	생명 기술(gibco)	31095029
TPCK-트립신	워 딩 턴	LS003740
xCELLigence 실시간 세포 분석 기기 S16	ACEA 바이오사이언스, Inc	380601310	xCELLigence RTCA S16 기기는 다양한 형식(16-well, 96-well, 단일 또는 다중 플레이트)으로 제공됩니다.