바이러스 생존을 평가하기 위한 세포 임피던스 기반 생존 역학 분석

초록

출처: Labadie, T. et al., 실시간 세포 분석을 사용하여 숙주 밖에서 인플루엔자 바이러스 생존 모니터링. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 세포요법 효과를 유도하는 바이러스의 생존 역학을 연구하기 위한 세포 임피던스 기반 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 식염수로 전처리된 바이러스에 감염된 부착 세포의 전기 임피던스를 측정합니다.

프로토콜

1. 시약 및 출발 물질의 준비

1. MDCK 세포 및 무균 세포 배양 배지의 준비
   1. 10% 열 불활성화 태아 송아지 혈청(FCS)과 항생제(100 units/mL 페니실린, 100 mg/mL 스트렙토마이신)가 보충된 변형된 독수리 배지(MEM)에서 Madin-Darby Canine Kidney(MDCK) 세포를 배양합니다.
   2. 해동 후 완전한 회복을 보장하기 위해 MDCK 세포를 감염시키기 최소 2회 전에 계대를 계대측정하십시오(단, 세포 표현형의 표류를 방지하기 위해 30회 미만).
   3. 7.5 x 10⁶ MDCK 세포가 포함된 30mL의 멸균 1x MEM을 함유한 75cm² 조직 배양 플라스크를 시드하고 가습된 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다.
2. 임피던스 모니터링 장비의 준비
   1. 기기를 35°C의 인큐베이터에 넣고 최소 2시간 동안 예열합니다.
   2. 인큐베이터 외부에 있는 제어 장치에 연결합니다.
   3. 나머지 실험을 시작하기 전에 제조업체에서 권장하는 세척 절차를 진행하십시오.
3. MDCK cell에 대한 IAV stock의 생산
   1. H1N1 바이러스를 전파 및 증폭하려면 7.5 x 10⁶ MDCK 세포를 75cm² 조직 배양 플라스크 2개에 시딩하고 37°C에서 24시간 동안 배양하여 90%–100% 합류점에 도달합니다.
   2. 세포 단층에서 세포 배양 배지를 75cm² 플라스크로 디캔팅합니다. 5mL의 멸균 1x PBS로 세포를 세척합니다.
   3. PBS를 제거하고 5mL의 1x PBS를 첨가하여 세포를 다시 세척합니다.
   4. 하나의 플라스크를 대조군으로 표시하고 PBS를 제거한 후 단층에 15mL의 바이러스 전파 매체(0% FCS가 있는 1x MEM)를 조심스럽게 추가합니다. 이 플라스크를 35°C로 유지되는 인큐베이터에서 5% CO₂로 배양합니다. 번식 3일 후 비교에 사용하십시오.
   5. RT에서 IAV 스톡 1바이알을 해동합니다.바이러스 증식 매체(0% FCS가 포함된 1x MEM)가 들어 있는 1.5mL 튜브에 바이러스를 적절한 농도로 희석합니다.
   6. 75cm² 플라스크에서 1x PBS를 제거하고 세포 단층에 희석된 바이러스 1mL를 첨가하여 세포(PFU/세포)당 1 x ^10-3 또는 1 x ^10-4 플라크 형성 단위의 다중감염(MOI)으로 MDCK 세포를 감염시킵니다.
   7. 15분마다 정기적으로 플라스크를 교반하여 RT에서 45분 동안 바이러스를 MDCK 세포에 흡착합니다.
   8. 접종물을 부드럽게 제거하고 1μg/mL TPCK-트립신(트립신/L-1-토실아미드-2-페닐에틸 클로로메틸 케톤)을 포함하는 플라스크당 바이러스 전파 매체 15mL를 추가하여 바이러스 헤마글루티닌 HA0를 HA1 및 HA2 소단위체(엔도솜 막과의 HA 융합 및 바이러스 게놈 방출에 필요한 이벤트)로 절단합니다.
   9. 바이러스를 복제하기 위해 최소 3일 동안 35°C 및 5% CO₂에서 플라스크를 배양합니다.
   10. 현미경으로 40배 배율로 MDCK 세포를 관찰하고 세포에 대한 세포병성 효과(CPE)를 찾습니다(세포 대조 플라스크와 비교). CPE가 완전하지 않은 경우(즉, 세포의 약 80%가 기질에서 분리된 경우) 플라스크를 인큐베이터에 다시 넣어 24시간 더 기다립니다.
   11. CPE가 완료되면 세포 배양 상층액을 디캔팅하고 300 x g에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다.
   12. 정화된 상등액을 15mL 튜브로 옮기고 부분 표본 자손 바이러스를 일회용 멸균 극저온 바이알로 옮깁니다. 즉시 냉동 튜브를 -80°C에 놓아 바이러스를 동결하고 비축합니다.
4. 아래 단계에 따라 재현성을 위해 역 피펫팅을 사용하여 H1N1 바이러스의 알려진 6 log₁₀ TCID₅₀/mL 역가를 10배 희석하여 MDCK 세포를 감염시킵니다.
   1. FCS(바이러스 전파 매체)가 없는 100μL의 MEM으로 MDCK 세포를 2x 헹굽니다. 접종물이 더 이상 희석되지 않도록 두 번째 세척 후 모든 매체를 제거하는 것에 주의하십시오.
   2. 단일 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 100μL의 바이러스 현탁액을 추가합니다. 오염을 방지하려면 플레이트에서 왼쪽에서 오른쪽에서 시작하여 위에서 아래로 진행하면서 나머지 웰을 뚜껑으로 덮습니다.
   3. 35°C에서 기기의 크래들 포켓에 플레이트를 삽입합니다. 잠재적으로 오염으로 이어질 수 있는 갑작스러운 움직임을 피하기 위해 부드럽게 하십시오.
   4. 2.10단계에서 설명한 대로 최소 100시간 동안 15분마다 셀 임피던스 모니터링을 시작합니다.
   5. 두 번의 측정 주기(즉, 30분) 후에 "실행" 탭에서 "일시 중지"를 클릭하여 장치를 일시 중지하고 크래들에서 E-플레이트를 제거합니다.
   6. 바이러스 증식 배지에 1μg/mL TPCK-트립신을 첨가하여 바이러스 헤마글루티닌을 절단합니다.
   7. TPCK-trypsin을 함유한 바이러스 전파 배지 100μL를 각 웰에 추가하고 E-plate를 크래들 포켓에 삽입합니다. 8. "실행" 탭에서 "시작/계속"을 클릭합니다.
      메모: 바이러스 현탁액을 바이러스 증식 배지로 대체하여 모의 감염 세포에 해당하는 음성 대조군을 만드는 것을 잊지 마십시오.

2. IAV 생존 역학

1. IAV를 35°C의 식염수 증류수에 노출시키고 세포 임피던스 감소를 측정하여 시간 경과에 따른 감염성을 테스트합니다.
   1. 증류수에 NaCl을 최종 농도 35g/L로 첨가하여 식염수 증류수를 준비합니다. 900μL의 식염수를 2mL cryotube에 추가합니다.
   2. 식염수에 100μL의 바이러스 스톡을 추가하고 냉동 튜브를 1시간, 24시간 또는 48시간 동안 인큐베이터(35°C, 5% CO₂)에 넣습니다.
   3. 16웰 마이크로타이터 플레이트에 갓 분할된 MDCK 세포 100μL(3 x 10⁴ 포함)를 파종하고 37°C 및 5% CO₂에서 24시간 동안 성장합니다.
   4. 섹션 1.4를 반복하여 재현성을 위해 역 피펫팅 방법을 사용하여 100μL의 노출된 바이러스(이전에는 배양 배지에서 10배 희석됨)로 세포를 감염시킵니다.
2. 최소 100시간 동안 15분마다 셀 임피던스를 모니터링합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.25% 트립신	써모피셔	25200056
75 cm2 조직 배양 플라스크	송골매	430641U
E-플레이트 16 (6 플레이트)	ACEA 바이오사이언스, Inc	5469830001	E-플레이트는 다양한 포장으로 제공됩니다.
증권 시세	생명 기술(gibco)	10270-106
MEM 1X	생명 기술(gibco)	31095029
PBS 1배	생명 기술(gibco)	14040091
페니실린-스트렙토마이신	생명 기술(gibco)	11548876
TPCK-트립신	워 딩 턴	LS003740
xCELLigence 실시간 세포 분석 기기 S16	ACEA 바이오사이언스, Inc	380601310	xCELLigence RTCA S16 기기는 다양한 형식(16-well, 96-well, 단일 또는 다중 플레이트)으로 제공됩니다.

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