출처: Borges, C. R. et al., 티오바르비투르산 반응성 물질 분석을 사용한 생물학적 샘플의 산화 스트레스 평가. J. Vis. 특급. (2020년)
이 동영상은 생물학적 샘플의 산화 스트레스를 평가하기 위한 티오바르비투르산 반응성 물질(TBARS) 분석을 보여줍니다.
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방법 논문
인간 혈청의 산화 스트레스를 평가하기 위한 티오바르비투르산 반응성 물질 분석
2K 조회수
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2025년 7월 8일
이 논문에서
초록
프로토콜
인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 기관, 국가 및 국제 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.
1. TBARS 분석
참고: TBARS 분석이 시작되면 중단하지 않고 완료해야 합니다.
- 4°C에서 10분 동안 1500 x g에서 원심분리한 샘플과 표준물질을 최대한 많이 채취합니다. 원심분리 후, 샘플과 표준물질이 들어있는 유리관을 RT에 보관하십시오. 분석할 샘플의 수에 따라 필요에 따라 유리관을 정렬하고 샘플 이름으로 라벨을 붙입니다. 그런 다음 준비된 각 샘플(HepG2 세포 용해물, 저밀도 지단백질, 인간 혈청) 100μL를 각 유리관에 추가합니다.
- 각 샘플과 표준물질에 200μL의 8.1% SDS를 추가하고 유리관을 원을 그리며 부드럽게 소용돌이쳐 샘플을 혼합합니다.
- 3.5M 아세트산 나트륨 완충액 1.5mL(pH = 4)를 각 샘플과 표준물질에 추가합니다.
- 3.5M 아세트산 나트륨 완충액 1.5mL(pH = 4)를 각 샘플과 표준물질에 추가합니다.
- 700μL의 DI water를 추가하여 각 샘플과 표준물질에 대해 최종 부피를 4mL로 가져옵니다.
- 각 유리관을 단단히 덮고 95°C로 설정된 가열 블록에서 1시간 동안 배양합니다. 유리관을 알루미늄 호일로 덮어 튜브 상단의 응결을 방지합니다.
- 가열 블록에서 유리관을 제거하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
- 1500 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기 시료 및 표준물질. 원심분리 후 샘플과 표준물질이 들어있는 유리관을 RT.
로 유지하십시오. 메모: 샘플을 얼음 위 또는 4 °C에 보관하면 전체 샘플 또는 표준물질이 침전됩니다. - 원심분리 직후 각 튜브에서 150μL의 상층액을 분주하고 96웰 플레이트의 별도 웰에 넣습니다.
- 피펫 팁을 사용하여 각 웰에서 기포를 제거합니다.
메모: 기포가 있으면 일관되지 않은 흡광도 판독값이 생성되어 높은 분석 부정확성이 발생합니다. - 532nm에서 흡광도를 읽습니다. 다른 모든 흡광도 판독값에서 blank 샘플의 평균 흡광도 판독값을 뺍니다.
- 각 표준물질의 알려진 농도와 비교하여 532 nm에서 블랭크에서 뺀 흡광도 판독값을 표시하여 표준 곡선을 생성합니다. 선형 회귀를 사용하여 데이터 점을 피팅합니다. 표준 곡선에서 얻은 선형 회귀선의 방정식을 사용하여 알 수 없는 표본 농도를 계산합니다.
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공개 사항
선언된 이해 상충이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1x 멸균 PBS pH 7.4 1 L | VWR, 펜실베이니아 | 101642--262 | 세포 용해 시약 |
| 50 mL 독립형 원심분리기 튜브 | 코닝, 뉴욕 | CLS430897 | 일반 재료 |
| 96웰 플레이트, 비처리, 투명, 뚜껑 포함, 비멸균 | 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific, MA | 280895 | 흡광도를 측정하려면 |
| Amicon Ultra-0.5 100kD 원심 스핀 필터 장치 | 피셔 사이언티픽, 뉴햄프셔 | UFC510024 | LDL 정제 |
| 유리관용 캡 | 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific, MA | 14-930-15디 | TBARS 분석의 경우 |
| 구리 II 염화물 | 시그마, 미주리 | 222011-250지 | 산화를 유도하기 위해 |
| 배양 튜브, 일회용, 스크류 캡 마감 처리, 붕규산 유리(13 x 100mm) | VWR, 펜실베이니아 | 53283-800 | TBARS 분석의 경우 |
| 독수리의 최소 필수 매체(EMEM) | ATCC, 버지니아 | HB-8065 | HepG2 세포 배지 |
| Eppendorf Safe-Lock 튜브, 1.5 mL | 에펜도르프, 뉴욕 | 22363204 | 일반 재료 |
| Eppendorf Safe-Lock 튜브, 2.0 mL | 제네시 Sceitific, 캘리포니아 | 22363352 | 일반 재료 |
| 소 태아 혈청 미국 출처 | 오메가 사이언티픽, 캘리포니아 | FB-11 | 세포 배양용 |
| 빙하 아세트산 | 시그마, 미주리 | 27225-1L-R | TBARS 시약 |
| Halt 프로테아제 억제제 칵테일 (100개) | 써모 사이언티픽, MA | 87786 | 세포 용해 시약 |
| 헤페스 | 시그마, 미주리 | H3375-250G | LDL 용매 |
| 염산(HCl) | 피셔 사이언티픽, 뉴햄프셔 | 대답144-212 | 세포 용해 시약 |
| Legend Micro 17 원심분리기 | 써모 사이언티픽, MA | 75002431 | 일반 재료 |
| 저밀도 지단백질, 인간 혈장 | 아테네 연구 & 기술, 조지아 | 제12-16-120412 | 생물학적 매트릭스 프로토타입 |
| 마그네틱 스티어 바, 팔각형 6 종류 | VWR, 펜실베이니아 | 58948-025 | 일반 재료 |
| 말론디알데히드 비스(디메틸 아세탈) | 시그마, 미주리 | 8207560250 | TBARS 표준 |
| Multiskan Go 마이크로플레이트 분광 광도계 | 피셔 사이언티픽, 뉴햄프셔 | 51119200 | 흡광도를 측정하려면 |
| NP-40 | EMD 밀리포어 코퍼레이션, MA | 492016-100ML | 세포 용해 시약 |
| 소금 | 시그마, 미주리 | S7653-1KG | 세포 용해 시약 |
| 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) | 시그마, 미주리 | 436143-100지 | TBARS 시약 |
| 수산화나트륨 | 시그마, 미주리 | 367176-2.5KG | TBARS 시약 |
| SpeedVac 농축기 | 써모 사이언티픽, MA | SC250EXP | 세포 용해물 농축용 |
| 티오바르비투르산 | 시그마, 미주리 | T5500-100G | TBARS 시약 |
| 트리스 베이스 | 플루카, 조지아 | 93362 | 세포 용해 시약 |
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