생체 외 안구 미세혈관 증식을 연구하기 위한 맥락막 발아 분석

초록

출처: Tomita, Y., et al. 안구 미세혈관 신생의 ex vivo 맥락막 발아 분석. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오는 안구 미세혈관 신생을 연구하기 위한 맥락막 발아의 생체 외 모델 개발을 보여줍니다. 이 분석은 맥락막 미세혈관 발아를 촉진하는 특정 조건에서 공막과 망막 색소 상피에 부착된 맥락막 조직을 포함하는 쥐 눈 외식물을 배양하는 것을 포함합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 준비

1. 5mL의 페니실린/스트렙토마이신(10000 U/mL)과 5mL 및 10mL의 시판 보충제를 500mL의 완전한 클래식 배지 및 혈청에 추가합니다. 초기에 배지의 부분 표본 50mL.
   메모: 오염을 방지하기 위해 매체를 재고로 다시 반환하지 마십시오.
2. 완전한 클래식 미디엄의 부분 표본을 얼음 위에 놓습니다.
3. 70% 에탄올을 사용하여 해부 현미경, 집게 및 가위를 청소합니다.
4. 두 개의 세포 배양 접시 (10cm)를 준비하는데, 하나는 해부 현미경에, 다른 하나는 얼음에 놓습니다. 각 접시에 10mL의 완전한 클래식 배지를 넣으십시오.

2. 실험 단계 (그림 1)

1. 75-100 mg/kg 케타민과 7.5 -10 mg/kg 자일라진을 복강내 주입하여 산후(P) 20 전후(P) 20 전후에 C57BL/6J 마우스를 희생합니다. 해부하기 전에 얼음 위에서 눈을 완전히 고전적인 매체에 보관하십시오.
2. 눈의 결합 조직(근육 및 지방 조직)과 시신경을 제거합니다.
3. 마이크로 가위를 사용하여 각막 변연 뒤쪽 0.5mm를 원주 방향으로 자릅니다. 각막/홍채 복합체, 유리체 및 수정체를 제거합니다.
4. 절개된 가장자리에서 시신경을 향해 수직으로 1mm를 절개하고 1mm 폭의 둘레 밴드를 자릅니다. 단지의 중앙 영역과 주변 영역을 분리합니다. 집게를 사용하여 RPE/맥락막/공막 복합체에서 망막을 떼어냅니다.
5. 말초 맥락막 밴드를 얼음 위에서 완전한 클래식 매체로 유지하고, 다른 쪽 눈을 분리하고 이 과정을 반복하여 두 번째 밴드를 자릅니다.
6. 원형 밴드를 6 ~동일한 정사각형 조각(~1mm x 1mm)으로 자릅니다.
   메모: 절대로 가장자리를 만지지 마십시오.
7. 제조업체의 지시에 따라 기저막 추출물(BME)을 해동합니다. 30μL/웰의 BME를 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰 중앙에 추가합니다. BME의 물방울이 가장자리를 건드리지 않고 플레이트 바닥에 볼록한 돔을 형성하는지 확인하십시오.
   메모: BME를 냉장고에서 밤새 해동합니다. BME는 해동 후 언제든지 얼음 위에 있어야 합니다.
8. 조직을 BME.
   의 중간에 놓습니다. 메모: 맥락막 절제술을 평평하게 하지 마십시오. 일반적으로 조직이 BME 내에서 확장되도록 합니다. 조직의 방향(공막이 위 또는 아래)은 실험 결과에 영향을 미치지 않습니다.
9. 플레이트를 37°C에서 10분 동안 배양하여 겔이 응고되도록 합니다.
10. 500 μL의 완전한 클래식 매체/웰을 추가합니다.
11. 클래식 배지를 격일로 교체합니다(500μL). 맥락막 싹은 현미경으로 3일 후에 관찰할 수 있습니다.
    메모: 성장 인자 치료를 위해 조직을 4시간 동안 굶깁니다. 임상시험용 화합물을 성장 인자 감소 배지(1:50 대신 1:200 부스트)로 희석합니다.

3. SWIFT-Choroid 컴퓨터 정량화 방법(그림 2)

참고: 성장하는 혈관이 덮인 면적을 측정하기 위해 컴퓨터화된 방법이 사용되었습니다. 정량화 전에 ImageJ 소프트웨어에 대한 매크로 플러그인이 필요합니다.

1. ImageJ로 맥락막 발아 이미지를 열고 "이미지 |유형| 8비트"(회색조).
2. "이미지 | 조정 | 밝기/대비(Ctrl/shift/ C)"를 선택하고 대비를 최적화합니다.
3. 마술 지팡이 기능을 사용하여 새싹 중앙에 있는 맥락막 조직의 윤곽을 그리고 이미지에서 제거합니다(단축키 "F1" 사용)(그림 2A, B).
   메모: 마술 지팡이의 허용 오차 비율을 20-30%로 설정합니다.
4. 자유 선택 도구를 사용하여 이미지의 배경을 제거합니다(그림 2C). "이미지 | 조정 | 임계값(Ctrl/Shift/T)". threshold 함수를 사용하여 배경과 주변부에 대한 미세혈관 새싹을 정의합니다(그림 2D).
5. "F2"를 클릭하면 요약이 나타납니다. "Save(저장)"를 클릭하여 선택한 영역의 이미지를 저장합니다. 나중에 참조할 수 있도록 원본 이미지와 동일한 폴더에 저장합니다.
6. 샘플 그룹을 측정한 후 데이터 분석을 위해 기록된 것을 복사합니다.
   메모: 또한 "Analyze | 배율 막대가 있는 이미지를 사용하여 배율 설정"을 클릭합니다.

결과

그림 1: 맥락막 발아 분석을 보여주는 개략도.
눈은 먼저 적출되고 윤부 뒤쪽으로 약 0.5mm 떨어진 둘레로 절단되었습니다. 각막, 홍채, 수정체, 유리체를 제거했습니다. 그런 다음 눈컵 가장자리에서 시신경 쪽으로 1mm 절단했습니다. 그런 다음 절단 가장자리에서 약 1.0mm 후방으로 밴드를 원주형으로 절단하고 밴드와 복합체의 주변 영역을 분리했습니다. 밴드는 약 1mm x 1mm 조각으로 절단되어 BME에 내장되었습니다. 그런 다음 현미경을 사용하여 맥락막의 미세혈관 새싹을 시각화했습니다.

그림 2: SWIFT-Choroid 컴퓨터 정량화 방법.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아나세드(자일라진)	아콘	59339-110-20
기저막 추출물 (BME) Matrigel	BD 바이오사이언스	제354230
세포 배양 접시	둥지	704001	10 센티미터
세럼과 CultureBoost를 함유한 완벽한 클래식 미디엄	셀 시스템	4Z0-500
에틸 알코올 200 프루프	팜코	111000200	70% 사용
킴와이프	킴벌리-클라크	06-666
현미경	자이스	악시오 옵저버 Z1
페니실린/스트렙토마이신	지브코	15140	10000 U/mL
조직 배양 플레이트(24-well)	올림푸스	25-107
VetaKet CIII (케타민)	아콘	59399-114-10

호 시리즈 년 년 년