에스트로겐 수용체-리포터 활성 분석법은 식물성 에스트로겐 에스트로겐 활성을 스크리닝합니다.

초록

출처: Fender, E. et al., 세포 기반 에스트로겐 수용체를 사용한 식물성 에스트로겐 스크리닝 β Reporter Assay. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 식물 유래 화합물의 에스트로겐 활성을 결정하기 위한 세포 기반 리포터 분석에 대해 설명합니다. 에스트로겐과 같은 활성을 가진 화합물은 에스트로겐 수용체에 대한 결합을 모방하고 다운스트림 리포터 효소 유전자 전사를 유도합니다. 리포터 효소는 반응에서 생물 발광을 생성하여 화합물의 에스트로겐 활성을 나타냅니다.

프로토콜

1. 인간 에스트로겐 수용체 β transfection assay

참고: 무균 기술과 층류 후드는 분석 프로토콜의 1일차에 필요합니다.

1. 표준 곡선에 대한 17β-Estradiol의 희석액을 준비합니다.
   1. 세포 회수 배지와 화합물 스크리닝 배지(CSM)를 냉동고 저장소에서 옮기고 37°C 수조에서 해동합니다.
   2. 마이크로 원심분리기 튜브 중간 1 및 2(INT1, INT2) 및 1-8에 라벨을 부착합니다.
   3. INT1을 995μL의 CSM, INT2를 615μL의 CSM, 튜브 1을 900μL의 CSM, 튜브 2-8을 600μL의 CSM으로 채웁니다. 튜브 8을 옆에 둡니다.
   4. 5 μL의 100 μM 17β-Estradiol Stock을 INT1로 옮깁니다. 팁을 버리십시오. 소용돌이.
   5. 각 이송 전에 피펫을 3회 헹군 다음 INT1에서 INT2로 10μL를 이송합니다. 팁을 버리십시오.
   6. 피펫을 3회 헹군 다음 INT2에서 튜브 1로 100μL를 옮깁니다. 팁을 버리십시오. 튜브 1에서 튜브 2로 300μL를 전달합니다. 튜브 3에서 7까지 반복합니다. 튜브 300에서 300μL를 버리십시오.7 폐기물 용기에 넣습니다. 튜브 8은 Zero이며 에스트라디올을 투여하지 않습니다. 도금된 표준물질의 최종 농도는 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 및 0pM 에스트라디올입니다.
2. 샘플 화합물을 준비합니다.
   1. 소용돌이 샘플.
   2. DMSO에서 각 식물 시료 4μL를 취하고 CSM 496μL에 추가하여 0.8% DMSO 용액을 생성합니다.
3. 리포터 셀을 빠르게 해동합니다.
   1. 37°C 수조에서 세포 회수 배지 튜브를 회수합니다. 70% 에탄올을 사용하여 외부 표면을 소독합니다.
   2. -80°C 보관에서 Reporter Cells를 회수하고 예열된 CRM 10mL를 냉동 세포 튜브에 옮겨 해동합니다.
   3. Reporter Cells의 튜브를 닫고 37°C 수조로 5-10분 동안 옮깁니다.
   4. 수조에서 Reporter Cell Suspension의 튜브를 회수합니다. 세포관을 여러 번 부드럽게 뒤집어 세포의 응집체를 분해하고 균일한 현탁액을 생성합니다. 70% 에탄올로 튜브 표면을 청소합니다.
4. 분석 도금.
   1. 멀티채널 피펫을 사용하여 100μL의 Reporter Cell Suspension을 각 웰에 분주합니다.
   2. 100μL의 시료를 적절한 분석 웰에 3회 분주합니다.
   3. 플레이트를 37°C, 가습된 5% CO₂ 인큐베이터로 22-24시간 동안 옮깁니다.
5. 해동 감지 기판 및 감지 버퍼는 어두운 냉장고에서 밤새 2일차를 준비합니다.
6. 플레이트 배양이 끝나기 직전에 냉장고에서 Detection Substrate와 Detection Buffer를 제거하고 RT와 평형을 이룰 때까지 저조도 영역에 놓습니다. RT에 도달하면 각 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 용액을 완전히 혼합합니다.
   1. 배양이 완료되기 직전에 Detection Buffer의 전체 내용물을 Detection Substrate의 튜브에 주입하여 Luciferase Detection Reagent를 만듭니다. 거품이 발생하지 않도록 부드럽게 섞습니다.
   2. 배양이 완료되면 플레이트를 뒤집어 내용물을 적절한 폐기물 용기에 버립니다. 깨끗한 흡수성 종이 타월로 플레이트를 부드럽게 두드려 웰에서 마지막 물방울을 제거합니다.
   3. 각 웰에 100μL의 루시페라제 검출 시약을 추가합니다. 분석 플레이트를 RT에서 15분 동안 그대로 둡니다. 접시를 흔들지 마십시오.
7. 96웰 플레이트 판독 광도계를 사용하여 발광을 정량화합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1000 μL 피펫
20 μL 피펫
200 μL 피펫
37 °C 수조
37°C, 가습 5% CO2 인큐베이터
70% 에탄올
분석 저울
세포 배양 등급의 층류 후드
디메틸 설폭사이드
일회용 미디어 분지, 멸균
드립 여과 시스템
삼각 플라스크			125 mL 및 250 mL
HPLC 등급 메탄올
Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assay	인디고 바이오사이언스	IB00411	분석 키트 - 24개의 샘플과 표준 곡선을 분석합니다.
동결건조기
멀티채널 피펫
오비탈 쉐이커
플레이트 판독 광도계			예: 바이오텍 시너지 HTX
회전 증발기
둥근 바닥 플라스크			50 mL 및 300 mL
멸균 마이크로 원심분리기 튜브 또는 멸균 다중 채널 미디어 수조
멸균 팁			200 μL 및 1000 μL
Whatman 1등급 논문
Whirl-pak 백			멸균 폴리에틸렌 백