1. 세포 배양
- 가습된 37°C/5% CO2 인큐베이터에서 세포를 유지하고 10% 소 태아 혈청(FBS)(HeLa 및 A431 세포)이 보충된 DMEM 또는 15% FBS(U266B1 세포)가 보충된 RPMI로 배양합니다. 세포가 70-80% confluence에 도달할 때까지 배양한 다음 trypsinize하고 계대 또는 분석에 사용합니다.
메모: 배양 배지에는 페놀 레드가 포함되어 있습니다. 분석을 수행하기 전에 모든 세포주에 대해 혈청 결핍을 수행하지 않았습니다.
2. 부착 세포에 대한 2-플레이트 분석 프로토콜을 사용한 자극제 또는 억제제 적정
참고: 이 절차는 테스트 화합물의 희석 시리즈에서 농도-반응 곡선을 생성하여 자극제 또는 억제제 효능을 결정하는 방법을 설명합니다.
- 세포 파종(Cell seeding)
- 사전 최적화된 밀도로 50μL의 세포(STAT3 및 STAT6 모두에 대해 40,000 HeLa 세포/웰, STAT5의 경우 75,000 A431 세포/웰)를 적절한 배양 배지의 96웰 조직 배양 처리된 플레이트에 분배합니다. 37 ° C / 5 % CO2.
에서 밤새 배양
메모: 최적의 세포 밀도와 배양 배양 시간을 결정해야 합니다.
- 테스트 화합물의 희석
- 폴리프로필렌 96웰 플레이트의 12웰에 걸쳐 화합물을 무혈청 배지에 연속으로 희석하여(절반 로그 간격 희석) 테스트 화합물의 중간 2x 희석 시리즈를 준비합니다.
메모: EC50 또는 IC50의 정확한 추정을 위해 12점, 절반 로그 간격 농도-반응 곡선을 최소한 중복으로 수행하는 것이 좋습니다.
- 또는 소수성 디메틸설폭사이드(DMSO) 용해성 테스트 화합물의 경우 100% DMSO에서 초기 희석을 수행한 다음 화합물 희석 시리즈를 무혈청 배지로 희석합니다.
메모: DMSO에 대한 분석 허용 오차는 DMSO 차량에서 테스트 화합물 적정을 수행하기 전에 확립되어야 합니다. 처리된 세포와 처리되지 않은 세포 간에 동일한 용매 농도를 유지하는 것이 중요합니다. 또한 화합물의 연속 희석을 테스트할 때 용매 농도는 희석 시리즈 전체에서 항상 일정하게 유지되어야 합니다.
- 세포 처리
- 세포 자극을 위해 50μL의 무혈청 배지 단독(처리되지 않은 세포) 또는 자극기(2x)를 추가합니다.
- 실온(RT) 또는 37°C(STAT3의 경우 인터페론(IFN) α2b/RT20분, STAT5의 경우 상피 성장 인자(EGF)/RT에서 10분, 인터류킨(IL)-STAT6의 경우 RT에서 4/20분)에서 사전 최적화된 시간 동안 배양합니다. 그런 다음 섹션 2.4.
로 진행합니다.
메모: 최적의 배양 온도를 결정해야 합니다.
- 세포 억제를 위해 25μL의 무혈청 배지 단독(처리되지 않은 세포) 또는 억제제(4x)를 첨가합니다.
- RT 또는 37°C에서 사전 최적화된 시간 동안 배양(JAK 억제제, STAT3 및 STAT6의 경우 RT에서 1/30분; Erlotinib/15 min at RT for STAT5).
- EC80에서 25μL의 무혈청 배지 단독(처리되지 않은 세포) 또는 자극기(4x)를 첨가합니다.
- RT 또는 37 ° C에서 사전 최적화 된 시간 동안 배양합니다 (2.3.2 단계와 동일한 조건).
- 세포 용해
- 제조업체에서 지정한 대로 키트의 특정 1x Supplemented Lysis Buffer를 준비합니다.
메모: 1x Lysis Buffer에 최종 농도 1x로 희석된 100x Phosphatase Inhibitor Cocktail을 보충해야 합니다. 1x Supplemented Lysis Buffer에는 1mM 불화나트륨, 2mM 오르토바나산나트륨 및 2mM 베타글리세로인산염이 함유되어 있습니다. 다른 인산가수분해효소 억제제는 필요하지 않으므로 피해야 합니다. 키트에 포함된 것 이외의 용해 완충액 및 인산가수분해효소 억제제는 측정을 방해할 수 있는 성분을 포함할 수 있으므로 권장되지 않습니다.
- 상층액을 흡인하여 세포 배양 배지를 조심스럽게 제거하고 폐기합니다.
- 즉시 50 μL의 1x Supplemented Lysis Buffer.
를 추가합니다.
메모: 용해 완충액 부피(25-50 μL)를 최적화할 수 있습니다.
- 진탕 시 RT에서 30분 동안 배양합니다(오비탈 플레이트 셰이커는 400rpm으로 설정, 중간 정도의 교반).
메모: 용해 배양 시간(30-60분)이 최적화될 수 있습니다. 용해물은 표적 단백질 검출에 즉시 사용하거나 -80°C에서 동결할 수 있습니다.
- TR-FRET 감지
- 제조업체에서 지정한 대로 1x Detection Buffer에 4x Antibody Detection Mix를 준비합니다.
- 이 전달 단계에서는 96웰 배양 플레이트에서 15μL의 세포 용해물을 흰색의 저용량 384웰 마이크로플레이트로 조심스럽게 피펫팅합니다.
- 15 μL의 Positive Control Lysate와 15 μL의 1x Lysis Buffer(negative control)를 별도의 분석 웰에 추가합니다.
- 각 분석 웰에 5μL의 4x 항체 검출 혼합물(phospho-protein 검출을 위한 Eu-Ab1/FR-Ab2 또는 총 단백질 검출을 위한 Eu-Ab3/FR-Ab4)을 추가합니다.
- 플레이트를 플레이트 씰러로 덮고 분석에 따라 RT에서 1시간에서 최대 하룻밤 동안 배양합니다(해당 기술 데이터 시트 참조).
메모: 최적의 판독 시간은 각 분석과 세포주에 맞게 최적화되어야 합니다. 플레이트는 분석 성능에 부정적인 영향을 주지 않고 여러 번 판독할 수 있습니다.
- 접착 플레이트 씰러를 제거하고 TR-FRET 호환 마이크로플레이트 리더에서 플레이트를 읽습니다.
메모: 필터 기반 형광계가 권장되지만 일부 모노크로메이터 기기를 사용할 수 있습니다. TR-FRET에 적합한 광학 모듈(필터 및 미러)이 설치되어 있는지 확인합니다. 320 또는 340 nm의 여기 파장을 사용하여 유로퓸 킬레이트를 여기시킵니다. 615nm(또는 620nm) 및 665nm 모두에서 분석을 판독하여 각각 donor Europium과 acceptor fluorophore의 방출을 모두 검출합니다. 기기 설정은 특정 리더에 따라 다릅니다. 여기에 제시된 데이터는 램프 기반 여기, 90μs 지연, 300μs 통합 시간 및 웰당 100번의 플래시를 사용하여 얻은 것입니다. 그러나 phospho-STAT4 분석은 더 높은 신호 대 배경(S/B) 비율을 생성하기 위해 레이저 여기를 사용하여 판독되었습니다.
