뉴런에 대한 테스트 화합물의 신경독성을 평가하기 위한 발광 기반 분석

초록

출처: Wahlestedt, C., et al., 인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 사용한 신경 폐석 성장 분석 및 신경 독성 평가. J. Vis. 특급 (2020)

이 비디오에서는 hNPC 유래 뉴런의 생존 가능성에 대한 신경돌기 성장 촉진 소분자 화합물의 신경독성을 평가하는 발광 기반 방법에 대해 설명합니다. 이 분석은 세포 생존율의 지표인 세포 내 ATP 수준을 측정하여 테스트 화합물 처리 후 신경 독성을 평가합니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 기관, 국가 및 국제 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 인간 신경전구세포(hNPC)의 분리 및 배양

1. 뇌 조직을 100mm 페트리 접시에 넣고 집게를 사용하여 수막을 조심스럽게 제거합니다.
2. 뇌 조직을 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 튜브를 부드럽게 뒤집어 20mL의 PBS로 두 번 세척합니다.
3. 세포 해리 용액(재료 표 참조) 및 DNase I(10 U/mL)에 조직을 37°C에서 10분 동안 담가 새로운 50mL 원뿔형 튜브에서 뇌 조직을 배양합니다.
4. 뇌 조직 함유 튜브에 5mL의 신경 세포 배양 배지(재료 표 참조)를 추가하고 1000μL 피펫 팁을 통해 20-30회 트리분투하여 단일 세포 현탁액을 만들어 신경 영역을 기계적으로 해리합니다.
5. 70μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과하여 세포 클러스터를 제거합니다.
6. 표 1에 자세히 설명된 성분이 보충된 5-10mL의 신경 세포 배양 배지가 있는 통풍 T-25 플라스크에 단일 세포 현탁액을 파종합니다.
   1. 헤파린 용액을 0.2μm 필터를 통한 여과로 살균합니다. 비타민 A가 없는 B-27 보충제는 분화를 유발하지 않고 신경전구세포와 줄기세포를 배양하기 위한 무혈청 보충제입니다.
      메모: 인간 신경전구세포(hNPC)는 유산된 태아에서 채취한 인간 태아 뇌에서 분리됩니다. 배양 7-10일이 지나면 신경줄기세포(NSC)는 자유롭게 떠다니는 신경권 군체를 형성하는 반면, 다른 세포 유형은 단일 세포로 현탁 상태를 유지하거나 플라스크 바닥에 부착됩니다. 분리된 hNPC는 몇 달 동안 현탁 상태로 신경구로 배양할 수 있습니다.

2. hNPC 전달하기

1. 떠다니는 구체, 크고 작은 신경구가 포함된 매체를 수집하여 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
   메모: 알 수 없는 이유로 인해 신경구를 분리하는 시기는 7일에서 최대 30일까지 다양합니다. 그러나 일반적으로 신경구는 직경이 700-900μm보다 클 때 통과해야 합니다. 이 시기는 신경구의 중심이 어두워지기 시작하는 시기이며, 이는 세포 사멸률이 높다는 신호로 간주됩니다.
2. 300-400 x g에서 3분 동안 원심분리를 통해 신경구를 회전시킵니다.
3. 상층액을 조심스럽게 흡입한 다음 구체를 500μL의 해동된 세포 해리 시약에 담급니다(재료 표 참조).
   1. 1.5mL 마이크로튜브당 500μL를 첨가하여 세포 해리 시약의 부분 표본을 만들고 -20°C에서 보관합니다. 효소 활성이 손실되지 않도록 세포 해리 시약을 RT에서 유지하거나 37°C의 물/비드 수조에서 5분 동안 데워서 해동합니다.
4. 구체의 밀도와 크기에 따라 37°C에서 5-15분 동안 물에 잠긴 구체를 배양합니다.
5. 50mL 원뿔형 튜브가 포함된 신경구에 5-10mL의 예열된 배양 배지를 추가하고 300-400 x g에서 5분 동안 원심분리하여 신경구를 침전합니다.
6. 상층액을 흡인하고 1000μL 피펫을 사용하여 모든 신경구가 단일 세포 현탁액이 될 때까지 2mL의 배양 배지에서 위아래로 부드럽게 피펫합니다.
   메모: 해리는 육안으로 볼 수 있게 됩니다. 해리 전, 신경구체는 구체의 형태입니다. 해리 시약에 담그고 위아래로 피펫팅한 후 단일 세포가 됩니다.
   1. T-25 플라스크당 2-300만 개의 세포인 단일 세포를 10mL의 배양 배지에서 계수하고 플레이팅합니다.
7. 3일마다 배양 배지의 절반을 교체하여 세포에 공급합니다.
   1. 플라스크가 아래쪽 모서리에 오도록 플라스크를 기울여 신경구를 고정합니다. 신경구가 침전될 때까지 약 1-2분 동안 플라스크를 제자리에 유지합니다. 그런 다음 침전된 신경구 위의 배지에 혈청학적 피펫을 삽입하여 배지의 절반을 부드럽게 흡인합니다. 해리된 세포는 배양에서 2-3일 후에 응집되어 구를 형성할 수 있습니다.

3. hNPC 동결

1. 배양 배지에 DMSO를 최종 농도 10%(v/v)로 첨가하여 세포 동결 배지를 준비하거나 민감한 세포 유형에 대해 시판되는 동결 보존 배지를 사용합니다(재료 표 참조).
2. 매체를 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 구체가 중력에 의해 침전되도록 하여 큰 구체를 분류합니다. 그런 다음 큰 신경구를 제거하고 200 또는 1000 μL 피펫 팁을 사용하여 계대 살균을 위해 새로운 50 mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
   메모: 직경이 900μm보다 큰 신경구는 큰 것으로 간주되고 직경이 500μm보다 작은 신경구는 작은 것으로 간주됩니다.
3. 300-400 x g에서 3분 동안 원심분리하여 나머지 신경구를 회전시킵니다. 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
4. 1mL의 동결 보존 시약에 최대 100개의 구체를 재현탁하고 극저온 튜브로 옮깁니다.
5. -80°C에서 세포 냉동 용기에 하룻밤 동안 보관하고(재료 표 참조) 장기 보관을 위해 다음날 액체 질소로 옮깁니다.
   메모: 중소형 신경구(직경 900μm 미만)는 동결하고 대형 신경구(직경 900μm 이상) 또는 단세포는 동결하지 않는 것이 좋습니다. 샘플을 해동하는 동안 세포 손상을 줄이려면 해동된 신경구를 작은 T25 플라스크에 파종하여 세포를 조밀하게 유지하십시오.

4. 신경독성 평가

참고: 테스트 화합물의 세포 독성은 발광 세포 생존율 분석을 사용하여 384웰 플레이트(재료 표 참조)에서 평가됩니다(재료 표 참조). hNPC는 "hNPC의 분화 및 처리" 섹션에 설명된 약간의 수정을 제외하고는 동일한 방법에 따라 제조됩니다. 그 후, 발광 세포 생존율 분석에 의해 생성된 발광 신호는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정됩니다. 발광 신호는 세포 ATP 농도에 비례하며, 이 농도는 각 웰에 존재하는 생존 가능한 세포의 수에 정비례합니다.

1. 코팅
   1. 384웰 플레이트의 웰당 30μL의 폴리-L-라이신(PLL)을 추가합니다.
   2. RT에서 1시간 동안 배양합니다.
   3. PBS로 2회 세척합니다.
   4. RT에서 건조시킵니다(약 30분 동안).
   5. 384웰 플레이트의 웰당 30μL의 라미닌(50μg/mL)을 추가합니다.
   6. 37 ° C에서 2 시간 동안 배양하십시오.
   7. PBS로 2x 세척.
      메모: 코팅된 384웰 플레이트는 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
2. 세포 도금
   1. 25μL의 분화 배지에서 384웰 플레이트의 웰당 20,000개의 단세포 신경구를 계수하고 플레이트링합니다.
   2. 37 °C에서 5일 동안 배양합니다.
   3. 5일 후, 5μL 부피에서 최종 목표 농도의 6배에서 준비된 테스트 화합물로 24시간 동안 세포를 처리합니다(웰당 30μL의 최종 부피를 만들기 위해).
3. 세포 생존율 분석
   1. 384웰 플레이트의 웰당 30μL의 발광 세포 생존도 분석 시약을 추가합니다.
      메모: 각 웰에 존재하는 부피와 동일한 부피의 발광 세포 생존율 분석 시약을 추가합니다. 발광 세포 생존율 분석 시약을 해동하고 사용하기 전에 RT로 평형을 이룹니다.
   2. 플레이트 셰이커에서 2분 동안 흔듭니다(혼합하고 세포 용해를 유도하기 위해).
   3. 300-400 x g에서 30초 동안 원심분리하여 혼합물을 스핀다운합니다.
   4. 384웰 플레이트를 빛으로부터 보호된 장소에서 RT에서 10분 동안 배양합니다(발광 신호를 안정화하기 위해).
   5. 마이크로플레이트 리더로 발광을 기록합니다.
      메모: Velcade(최종 농도 10μM)를 양성으로, DMSO(최종 농도 0.1% 또는 0.2%)를 음성 대조군으로 포함하는 HBSS를 포함하여 생존력 분석에 적절한 대조군을 사용합니다.

표 1. 100mL의 배양 배지를 만드는 데 필요한 구성 요소

분량	구성 요소
100 마이크로L	EGF (20 ng/mL)
100 마이크로L	FGF(10ng/mL)
2 mL	B-27, 비타민 A 마이너스(50X)
1 mL	L-알라닐-L-글루타민(100X) (재료 표 참조)
4 μL	헤파린(2μg/mL)
96.8 밀리리터	신경 세포 배양 배지 (재료 표 참조)

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항생제-항진균제	지브코	15240062
나27	열	17504001
B27 - 비타민 A 마이너스	열	12587010
증권 시세	페프로텍	450-02
증권 시세	시그마	A8531
셀티터-글로	프로메가	G7572
쿨셀	코 닝	432000	-80°C 냉동고에서 표준화된 제어 속도 -1°C/분 세포 동결을 보장하는 세포 동결 용기
크라이오스토르 CS10	스템셀 기술	7930	10% DMSO를 함유하는 동결 보존 배지
DMEM/F12	지브코	11320033
디엠소	시그마	34869-100ML
증권 시세	지브코	PHG0311
증권 시세	지브코	PHG6015
지그엔프	페프로텍	450-10
글루타맥스	지브코	35050061	L-알라닐-L-글루타민 보충제
덤플링을	칼바이오켐	375095
라미닌	시그마	L2020-1MG
L-아스코르브산	시그마	A92902-25G
mFreSR	스템셀 기술	5854	인간 배아 및 유도 만능 줄기 세포의 동결 보존을 위해 설계된 무혈청 동결 보존 배지
엔2	지브코	17502048
Nunc 384웰 폴리스티렌 화이트 마이크로플레이트	열	164610
PBS (PBS)	열	제10010-049
폴리-L-라이신	시그마	P5899-5MG
StemPro 아큐타아제	지브코	A1110501	단백질 분해 및 콜라겐 분해 효소를 함유하는 세포 해리 시약
Neurobasal 배지	지브코	21103049

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