<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="항상">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18mm 서클 커버 슬립</td>
			<td>써모 사이언티픽(Thermo Scientific</td>)
			<td>CB00180RA</td>
			<td>사용 전 소독</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>사이토칼라신 D</td>
			<td>인비트로젠</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>DMSO에 용해됨</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree 플라스미드 맥시 키트</td>
			<td>키아젠</td>
			<td>12362</td>년
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>형광 장착 매체</td>
			<td>다코</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 트랜스펙션 시약</td>
			<td>인비트로젠</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>파라포름알데히드</td>
			<td>시그마-알드리치</td>
			<td>P6148</td> (영문)
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>재질 보기 pEGFP-C1</td>
			<td>클론텍</td>
			<td>#의 6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>참고 문헌 8과 15를 참조하십시오</td>.
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 정제</td>
			<td>지브코</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>페니실린-스트렙토마이신</td>
			<td>지브코</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine 하이드로 브로마이드</td>
			<td>시그마-알드리치</td>
			<td>P7280</td> (영문)
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>주걱</td>
			<td>시그마-알드리치</td>
			<td>S4147 (영어</td>)
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드</td>
			<td>지브코</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

신경관 발육에 대한 표적 단백질의 효과를 평가하기 위한 면역형광 분석

출처: Chan, W., W., R. et al. <a href="https://app.jove.com/v/60031">1차 뉴런의 신경석 성장 연구를 위한 향상된 녹색 형광 단백질 기반 분석법.</a> J. Vis. 특급. (2019).
이 비디오에서는 1차 피질 뉴런의 신경돌기 파양에 대한 표적 단백질의 효능을 확인하기 위한 EGFP 기반 면역형광 분석을 시연합니다. 일차 뉴런에 형광 단백질인 EGFP 및 표적 단백질을 transfection한 다음 면역 분석을 수행하여 표적 단백질이 신경돌기 성장에 미치는 영향을 조사합니다.

출처: Chan, W., W., R. et al. 1차 뉴런의 신경석 성장을 연구하기 위한 향상된 녹색 형광 단백질 기반 분석법입니다. J. Vis. 특급 
...

발달 중인 뉴런은 신경돌기 성장을 통해 세포체에서 세포질 과정을 확장하여 뉴런 간 통신에 필수적인 수상돌기와 축삭을 발달시킵니다.
신경돌기 성장에 대한 표적 단백질의 효과를 연구하려면 바닥에 폴리-D-라이신 코팅 커버슬립이 있는 멀티웰 플레이트를 사용합니다. 커버슬립의 표면에는 배아 쥐 뇌에서 파생된 일차 피질 뉴런의 부착 배양이 있습니다.
두 가지 유형의 플라스미드, 즉 강화된 녹색 형광 단백질을 암호화하는 EGFP 플라스미드와 적절한 형질감염 시약에서 표적 단백질을 암호화하는 두 번째 플라스미드를 포함하는 혼합물로 뉴런을 처리합니다.
형질감염 시약은 플라스미드가 세포로 들어가는 것을 용이하게 합니다.
형질감염 후 두 플라스미드가 모두 발현되어 녹색 형광 단백질과 표적 단백질을 생성합니다. EGFP의 발현은 동시 형질감염된 세포에 녹색 형광을 부여합니다.
신경돌기 성장 자극 가능성이 있는 표적 단백질은 세포 신호 전달을 시작하여 세포골격 재구성을 촉진하고 신경 돌기 및 확장의 발달로 이어집니다.
사용한 배지를 흡인하고 세포를 파라포름알데히드로 고정합니다. 발현된 표적 단백질에 특이적으로 결합하고 세포에 추가적인 적색 형광을 부여하는 적색 형광 태그가 부착된 항표적 단백질 항체를 사용하여 세포를 대조염색합니다.
배양 플레이트에서 커버슬립을 제거하고 형광 현미경으로 관찰합니다.
이중 색상 형광 신호를 나타내는 공동 형질감염된 세포는 적색 형광이 없는 세포보다 더 긴 신경 과정을 나타내며, 이는 신경돌기 성장에 대한 표적 단백질의 자극 효과를 확인합니다.

섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 이틀 후 EGFP 및 표적 단백질 플라스미드 DNA 및 형질감염 시약을 두 개의 별도 1.5밀리리터 튜브에 희석한 다음 함께 혼합합니다. 형질감염 혼합물을 웰에 추가하여 EGFP 구조물로 세포를 형질감염시킵니다.
24시간 후 섭씨 37도 PBS로 세포를 세척하고 실온에서 어두운 곳에서 10분 동안 PBS에 4% 파라포름알데히드로 고정합니다.
배양이 끝나면 고정 세포를 세척당 신선한 PBS로 세 번 세척하고 샘플당 하나의 현미경 유리 슬라이드에 최소한의 형광 마운팅 배지를 추가합니다. 그런 다음 코팅된 커버슬립을 장착 매체에 조심스럽게 옮기고 샘플이 유리 슬라이드를 향하도록 합니다.
신경돌기 성장을 이미지화하려면 에피 형광 현미경에서 40x 대물렌즈를 선택하고 "시작"을 클릭하여 형질감염당 최소 40개의 온전한 EGFP 양성 뉴런에서 이미지를 캡처합니다.
모든 새로운 권한이 이미지화되면 NeuronJ 플러그인을 사용하여 ImageJ에서 캡처된 이미지를 열고 세포체에서 성장 원뿔 끝까지 각 뉴런의 가장 긴 신경돌기의 길이를 측정합니다. 그런 다음 소프트웨어로 얻은 데이터를 분석하여 표적 단백질이 신경돌기 성장에 미치는 영향을 확인합니다.

immunofluorescence-assay-to-evaluate-effect-target-proteins-on

Research

연구

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

생물학적 기술

Assay Techniques

분석 기법

Immunoassays

면역 분석법

Immunofluorescence Assay to Evaluate Effect of Target Proteins on Neurite Outgrowth

993 조회수. 발달 중인 뉴런은 신경돌기 성장을 통해 세포체에서 세포질 과정을 확장하여 뉴런 간 통신에 필수적인 수상돌기와 축삭을 발달시킵니다. 신경돌기 성장에 대한 표적 단백질의 효과를 연구하려면 바닥에 폴리-D-라이신 코팅 커버슬립이 있는 멀티웰 플레이트를 사용합니다. 커버슬립의 표면에는 배아 쥐 뇌에서 파생된 일차 피질 뉴런의 부착 배양이 있습니다. 두 가...

신경관 발육에 대한 표적 단백질의 효과를 평가하기 위한 면역형광 분석

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관련 논문

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
18mm 서클 커버 슬립	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	CB00180RA	사용 전 소독
사이토칼라신 D	인비트로젠	PHZ1063	DMSO에 용해됨
EndoFree 플라스미드 맥시 키트	키아젠	12362
형광 장착 매체	다코	S302380
Lipofectamine 2000 트랜스펙션 시약	인비트로젠	11668019
파라포름알데히드	시그마-알드리치	P6148
재질 보기 pEGFP-C1	클론텍	#의 6084-1
PCI FE65			참고 문헌 8과 15를 참조하십시오
PBS 정제	지브코	18912014
페니실린-스트렙토마이신	지브코	15140122
Poly-D-lysine 하이드로 브로마이드	시그마-알드리치	P7280
주걱	시그마-알드리치	S4147 (영어
트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드	지브코	25300062