특정 단백질-단백질 상호작용을 식별하기 위한 Split Luciferase Complementation Assay

Abstract

출처: Wiertelak, W. et.al., Split Luciferase Complementation Assay를 사용하여 Golgi-Resident Type III Membrane Proteins에 의해 형성된 이종 복합체의 시연. J. Vis. 특급. (2020년)

이 동영상은 단백질-단백질 상호 작용을 검출하기 위한 분할 루시페라제 보체 분석을 보여줍니다. 이 분석법에서 관심 단백질은 루시페라아제 효소의 작은 단편과 큰 단편에 태그가 지정됩니다. 단백질이 상호 작용할 때 큰 조각과 작은 조각이 결합하여 활성 효소 복합체를 형성하며, 특정 기질이 존재할 때 측정할 수 있는 밝은 발광을 방출합니다.

Protocol

1. 발현 플라스미드의 세포로의 일시적 형질주입

1. 트립신화(trypsinization)를 통해 부착된 HEK293T 세포 배양을 수확하고 전용 완전 성장 배지에서 세포를 재현탁합니다. 셀(2 x 10⁴/100 μL/well)을 투명한 바닥의 흰색 96웰 플레이트에 플레이트합니다. replicates.
   를 포함하여 테스트된 모든 조합 및 대조군을 수용하도록 웰의 총 수를 조정합니다. 메모: 열 이동을 최소화하고 밤새 증발을 피하기 위해 플레이트의 내부 60웰만 사용하십시오. 재료 표에 표시된 것과 같은 poly-D-lysine 코팅 플레이트를 사용하는 것이 좋으며, 그렇지 않으면 후속 세척 단계에서 세포가 분리될 수 있습니다.
2. 표준 조건(37°C, 5% CO₂)에서 밤새 세포를 배양합니다.
3. 다음 날, 원하는 발현 플라스미드 조합으로 세포를 transfection합니다.
   1. 무혈청 배지(Table of Materials)에서 각 구성물에 대해 6.25ng/μL로 희석된 발현 플라스미드를 사용합니다.
   2. 적절한 지질 대 DNA 비율로 지질 기반 transfection 시약을 첨가하고 제조업체의 지침에 따라 배양합니다.
   3. 8μL의 지질: DNA 혼합물을 지정된 웰에 추가합니다. 접시의 내용물을 부드럽게 회전시켜 섞습니다. 그 결과 50ng/well에서 두 발현 구조체가 모두 transfection됩니다.
4. 표준 조건(37°C, 5% CO₂)에서 20-24시간 동안 세포를 배양합니다.
   메모: 세포를 더 오랜 시간 동안 배양하면 융합 단백질 발현 수준이 높아질 수 있으며, 이는 단편 간의 비특이적 결합을 촉진할 수 있습니다.

2. 매체 교환

1. 다음 날에는 각 웰에서 컨디셔닝된 배지를 100μL의 무혈청 배지로 교체합니다. 매체 교환 시 셀이 분리되지 않았는지 확인합니다.
   메모: 이 단계는 furimazine 작업 용액을 추가하기 2-3 시간 전에 수행해야합니다. 혈청 회수는 furimazine의 자동 발광으로 인한 배경을 최소화합니다.

3. furimazine 작업 용액의 준비

1. 측정 직전에 1부피의 퓨리마진과 19부피의 희석 완충액(20배 희석액)을 혼합합니다.
   메모: 준비할 furimazine working solution의 총 부피는 분석하고자 하는 개별 well의 수에 따라 다릅니다(furimazine working solution은 세포 배양 배지에 1:5 비율로 첨가되므로, 이전에 100μL의 무혈청 배지 25μL로 채워진 각 well에 furimazine working solution 25μL를 첨가해야 합니다).
2. furimazine 작업 용액을 지정된 웰(25μL/웰)에 추가합니다. 손으로 또는 오비탈 셰이커를 사용하여 플레이트를 부드럽게 혼합합니다(예: 15-300rpm에서 500초).

4. 발광 측정

1. 플레이트를 발광 마이크로플레이트 리더에 삽입합니다.
   1. 37°C에서 수행할 실험의 경우 표시된 온도에서 10-15분 동안 플레이트를 평형화합니다.
2. 분석할 웰을 선택합니다.
3. 0.3초의 통합 시간으로 발광을 읽습니다. 필요한 경우 최대 2시간 동안 발광을 계속 모니터링합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% 트립신-EDTA 용액			세포 배양
부착성 포유류 세포주			세포 배양
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC 처리 마이크로플레이트, 뚜껑 포함	코 닝	356651	플라스틱 도자기
세포 배양 원심분리기			플라스틱 도자기
세포 배양 보조제(열 비활성화 소 태아 혈청, L-글루타민, 페니실린, 스트렙토마이신)			세포 배양
CO2 인큐베이터			장치
NanoBiT 단편으로 표지되지 않은 관심 단백질을 인코딩하는 발현 플라스미드			시험
FuGENE HD 트랜스펙션 시약	프로메가	E2311	시험
GloMax Discover 마이크로플레이트 리더(또는 다른 발광 마이크로플레이트 리더)	프로메가	GM3000	장치
사용된 세포주 전용 성장 배지			세포 배양
표준 분자 복제를 위한 재료 및 시약(박테리아, 내열성 중합효소, 제한 효소, DNA 리가아제, 핵산 정제를 위한 재료 및 시약)			시험
NanoBiT MCS 스타터 시스템	프로메가	N2014	이 키트에는 SmBiT 및 양성 대조군 플라스미드 쌍과 융합된 HaloTag 단백질을 인코딩하는 대조 플라스미드뿐만 아니라 다양한 방향에서 NanoBiT 단편으로 관심 단백질을 태깅할 수 있는 벡터가 포함되어 있습니다.
Nano-Glo 라이브 셀 분석 시스템	프로메가	N2011	이 키트에는 살아있는 세포에서 NanoLuc 활성을 검출할 수 있는 기질인 furimazine과 전용 희석 완충액이 포함되어 있습니다.
Opti-MEM I 리듀스 세럼 미디엄, 페놀 레드 없음	지브코	11058021	세포 배양
오비탈 쉐이커			장치