Brain Lysate에서 표적 단백질 수준의 정량화를 위한 전기화학발광 분석

초록

출처: Steinkellner, H., et al., MeCP2 단백질 변이체에 대한 전기화학발광 기반 분석. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오에서는 다양한 샘플에서 표적 단백질 수준의 정량화를 위한 전기화학발광 면역분석법을 시연합니다. 이 분석은 전기화학 반응에서 생성된 발광을 기반으로 합니다. 방출되는 빛의 강도는 샘플에 있는 표적 단백질의 양에 비례합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토

되었습니다.

1. MeCP2-ECLIA 프로토콜

1. 세척액, 차단완충액, 분석 희석액의 준비(1일차)
   1. 500μL의 Tween 20을 PBS 1L에 추가하여 0.05% Tween 20 in PBS 용액을 준비하고 세게 혼합한 다음 "세척 용액"으로 표시합니다.
      메모: 갓 준비한 세탁 버퍼만 사용하십시오.
   2. 인산염 완충 식염수(PBS)에 3% 차단제 A(Table of Materials)의 차단 용액을 준비합니다. 부드럽게 저어주어 섞고, 여과하고, 살균하고, 최대 2주 동안 사용할 때까지 냉장고에 보관합니다.
   3. PBS 10mL에 차단 용액 5mL를 추가하여 분석 희석 용액(PBS의 1% 차단제 A)을 준비합니다.
2. high bind plate의 코팅
   1. 96웰 다중 어레이 단일 지점 하이 바인드 플레이트를 꺼냅니다.
      메모: High Bind plates는 결합 용량이 더 크므로 소수성 표면이 있는 표준 plate보다 dynamic range가 더 큽니다.
   2. 단클론 마우스 anti-MeCP2 항체를 얼음에서 해동하고 0.67μL의 항체를 4mL의 PBS(PBS에서 1:6,000 항체 희석)와 혼합합니다. 항체 용액을 잘 섞도록 소용돌이치고 튜브를 "코팅 용액"으로 표시합니다.
   3. 멀티채널 피펫터를 사용하여 각 웰의 하단 모서리에 25μL의 코팅 용액을 조심스럽게 분배합니다. 이를 용액 코팅 방법이라고 합니다. 96웰 플레이트의 각 면을 부드럽게 두드려 코팅 용액이 각 웰의 바닥을 덮도록 합니다.
   4. 접착 호일로 플레이트를 밀봉하고 플레이트를 4°C의 냉장고에서 하룻밤(12-16시간) 동안 배양합니다.
3. 블로킹(2일차)
   1. 냉장고에서 접시를 꺼내 호일을 제거합니다.
   2. 항체 코팅 용액을 쓰레기 바구니에 튕겨 제거하고 종이 타월로 플레이트를 두드려 우물에서 모든 코팅 용액을 제거합니다.
   3. 웰당 125μL의 차단 용액을 추가합니다. 플레이트를 다시 밀봉하고 궤도 마이크로플레이트 셰이커에 놓습니다.
   4. 800rpm에서 지속적으로 흔들면서 실온에서 90분 동안 플레이트를 배양합니다.
4. 표준물질 및 시료 준비
   1. 배양 시간 동안 MeCP2 및/또는 TAT-MeCP2 단백질 표준물질 및 다양한 샘플을 준비합니다.
      메모: 표준 희석에 사용되는 용해 버퍼는 분석된 샘플에 사용된 것과 동일해야 합니다.
   2. MePC2 및/또는 TAT-MeCP2 단백질 스톡 용액(250μg/mL), 마우스 뇌 용해물 및 HDF 용해물 한 바이알을 -80°C에서 꺼냅니다. 얼음에서 해동합니다.
   3. 표 1에 따라 표준 원액(MeCP2 및/또는 TAT-MeCP2)을 깨끗한 튜브에 희석합니다.
   4. 용해 완충액의 샘플을 다음과 같이 희석합니다: 용해 완충액 25μL당 마우스 뇌 용해물 1−20μg, 용해 완충액 25μL당 HDF 용해물 0.25−1μg. 세 번에 걸쳐 분석을 수행할 수 있도록 각 샘플의 충분한 부피를 준비합니다.
5. 샘플 및 표준 솔루션 추가
   쓰레기통에 넣는 것을
   1. 튕겨 차단 용액을 제거하고 종이 타월로 플레이트를 두드려 우물에서 모든 차단 용액을 제거합니다.
   2. 세척액을 150μL의 세척액으로 플레이트를 3회 세척한 후 즉시 세척합니다.
   3. 25ul의 표준물질과 샘플을 단일 채널 피펫을 사용하여 웰의 하단 모서리에 추가합니다.
   4. 플레이트를 밀봉하고 800rpm에서 지속적으로 흔들면서 실온에서 4시간 동안 플레이트를 배양합니다.
6. 비표지 검출 항체
   1. 다클론 토끼 항-MeCP2 항체를 얼음 위에서 해동합니다. 항체를 분석 희석액에 1:6,000으로 희석합니다.
   2. 표준물질과 샘플을 쓰레기통에 튕겨 넣고 종이 타월로 접시를 두드려 제거합니다.
   3. 세척액을 150μL의 세척액으로 플레이트를 3회 세척한 후 즉시 세척합니다.
   4. 멀티채널 파이펫터를 사용하여 각 웰에 25μL의 라벨링되지 않은 검출 항체를 추가합니다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 800rpm으로 계속 흔들면서 1시간 동안 배양합니다.
7. 특이 접합 항체
   1. 냉장고에서 특정 2차 항체(Table of Materials)를 꺼내 얼음 위에 올려주세요. 항체 1:666.67을 분석 희석액에 희석하고 부드럽게 혼합합니다.
   2. 표지되지 않은 무료 2차 항체를 쓰레기통에 튕겨 넣고 종이 타월로 플레이트를 두드려 제거합니다.
   3. 세척액을 150μL의 세척액으로 플레이트를 3회 세척한 후 즉시 세척합니다.
   4. 멀티채널 피펫터를 사용하여 각 웰에 25μL의 특이 복합 항체(Table of Materials)를 추가합니다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 800rpm으로 계속 흔들면서 1시간 동안 배양합니다.
8. 접시 읽기
   1. 유리 접합 항체(Table of Materials)를 쓰레기통에 튕겨 제거하고 종이 타월로 플레이트를 두드립니다.
   2. 150μL의 세척액으로 플레이트를 3회 세척합니다.
   3. 150μL의 1x Tris-based Gold read buffer(Table of Materials)를 광 생성을 위한 보조 반응물로 트리프로필아민을 포함하는 계면활성제와 함께 플레이트에 추가합니다. 역 피펫팅 기법을 사용하여 기포를 피하십시오.
   4. 플레이트를 마이크로플레이트 감지 플랫폼(Table of Materials)에 놓고 즉시 측정을 시작합니다. 96웰 플레이트 획득을 위한 설정을 사용합니다.
   5. 전기화학발광 검출 시스템(Table of Materials)에 내장된 CCD 카메라로 전기화학발광 신호를 캡처하고 RLU(상대 조명 단위)에 해당하고 빛의 강도에 정비례하는 신호 수를 기록합니다.
      메모: 전기화학적 자극이 가해지면 탄소 전극에 결합된 루테늄 라벨은 620nm의 발광을 방출합니다. 기기와 함께 제공되는 소프트웨어(Table of Materials)로 데이터를 분석합니다.

표 1: 0 - 1,800ng/mL의 표준 시리즈.

표준	농도	희석
기준 1	1,800ng/mL	1.08 μL 표준 원액 + 148.92 μL 용해 버퍼
기준 2	600 ng / mL	50 μL 표준물질 1 + 100 μL 용해 버퍼
기준 3	200ng/mL	50 μL 표준물질 2 + 100 μL 용해 버퍼
기준 4	66.67 ng / mL	50 μL 표준물질 3 + 100 μL 용해 버퍼
기준 5	22.22 ng / mL	50 μL 표준물질 4 + 100 μL 용해 버퍼
기준 6	7.41ng/mL	50 μL 표준물질 5 + 100 μL 용해 버퍼
기준 7	2.47 ng / mL	50 μL 표준물질 6 + 100 μL 용해 버퍼
기준 8	0.82ng/mL	50 μL 표준물질 7 + 100 μL 용해 버퍼
기준 9	0.27ng/mL	50 μL 표준물질 8 + 100 μL 용해 버퍼
기준 10	0 ng / mL	150μL 용해 완충액

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
TAT-MeCP2 융합 단백질	자체 제작		세포 처리
MSD 차단기 A	메조 스케일 진단	R93BA-4	차단
트윈 20	시그마-알드리치	P9416	세척 용액
토끼에서 생산되는 Polyclonal Anti-MeCP2	유로젠텍 S.A.	맞춤형 설계	항체
단클론 Anti-MeCP2, 마우스에서 생산, 클론 Mec-168, 정제 면역 글로불린	시그마-알드리치	M6818-100UL; RRID:AB_262075	항체, 코팅액
멀티 어레이 96웰 플레이트	메조 스케일 진단	L15XB-3/L11BX-3	MeCP2 ECLIA 프로토콜
2차 AB, 토끼, anti-MeCP2	유로젠텍 S.A.	관습	항체
2차 AB, 토끼, anti-MeCP2	머 크	07-013	항체
MeCP2(인간) 재조합 단백질(P01)	아브노바 코퍼레이션	H00004204-P01	세포 처리
Gold Read Buffer T (1x) 및 계면활성제 포함	메조 스케일 진단	R92TG	MeCP2 ECLIA 프로토콜
MSD 섹터 이미저 2400	메조 스케일 진단	I30AA-0	MeCP2 ECLIA 프로토콜
디스커버리 워크벤치 4.0	메소 스케일 디스커버리		소프트웨어
Dulbecco의 PBS (멸균)	시그마-알드리치	D8537-500ML	시료 준비, 세척 용액, 코팅 용액
에디타	시그마-알드리치	EDS (에디에스)	추출 버퍼

(영문) 년