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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토
되었습니다.
1. MeCP2-ECLIA 프로토콜
- 세척액, 차단완충액, 분석 희석액의 준비(1일차)
- 500μL의 Tween 20을 PBS 1L에 추가하여 0.05% Tween 20 in PBS 용액을 준비하고 세게 혼합한 다음 "세척 용액"으로 표시합니다.
메모: 갓 준비한 세탁 버퍼만 사용하십시오.
- 인산염 완충 식염수(PBS)에 3% 차단제 A(Table of Materials)의 차단 용액을 준비합니다. 부드럽게 저어주어 섞고, 여과하고, 살균하고, 최대 2주 동안 사용할 때까지 냉장고에 보관합니다.
- PBS 10mL에 차단 용액 5mL를 추가하여 분석 희석 용액(PBS의 1% 차단제 A)을 준비합니다.
- high bind plate의 코팅
- 96웰 다중 어레이 단일 지점 하이 바인드 플레이트를 꺼냅니다.
메모: High Bind plates는 결합 용량이 더 크므로 소수성 표면이 있는 표준 plate보다 dynamic range가 더 큽니다.
- 단클론 마우스 anti-MeCP2 항체를 얼음에서 해동하고 0.67μL의 항체를 4mL의 PBS(PBS에서 1:6,000 항체 희석)와 혼합합니다. 항체 용액을 잘 섞도록 소용돌이치고 튜브를 "코팅 용액"으로 표시합니다.
- 멀티채널 피펫터를 사용하여 각 웰의 하단 모서리에 25μL의 코팅 용액을 조심스럽게 분배합니다. 이를 용액 코팅 방법이라고 합니다. 96웰 플레이트의 각 면을 부드럽게 두드려 코팅 용액이 각 웰의 바닥을 덮도록 합니다.
- 접착 호일로 플레이트를 밀봉하고 플레이트를 4°C의 냉장고에서 하룻밤(12-16시간) 동안 배양합니다.
- 블로킹(2일차)
- 냉장고에서 접시를 꺼내 호일을 제거합니다.
- 항체 코팅 용액을 쓰레기 바구니에 튕겨 제거하고 종이 타월로 플레이트를 두드려 우물에서 모든 코팅 용액을 제거합니다.
- 웰당 125μL의 차단 용액을 추가합니다. 플레이트를 다시 밀봉하고 궤도 마이크로플레이트 셰이커에 놓습니다.
- 800rpm에서 지속적으로 흔들면서 실온에서 90분 동안 플레이트를 배양합니다.
- 표준물질 및 시료 준비
- 배양 시간 동안 MeCP2 및/또는 TAT-MeCP2 단백질 표준물질 및 다양한 샘플을 준비합니다.
메모: 표준 희석에 사용되는 용해 버퍼는 분석된 샘플에 사용된 것과 동일해야 합니다.
- MePC2 및/또는 TAT-MeCP2 단백질 스톡 용액(250μg/mL), 마우스 뇌 용해물 및 HDF 용해물 한 바이알을 -80°C에서 꺼냅니다. 얼음에서 해동합니다.
- 표 1에 따라 표준 원액(MeCP2 및/또는 TAT-MeCP2)을 깨끗한 튜브에 희석합니다.
- 용해 완충액의 샘플을 다음과 같이 희석합니다: 용해 완충액 25μL당 마우스 뇌 용해물 1−20μg, 용해 완충액 25μL당 HDF 용해물 0.25−1μg. 세 번에 걸쳐 분석을 수행할 수 있도록 각 샘플의 충분한 부피를 준비합니다.
- 샘플 및 표준 솔루션 추가
쓰레기통에 넣는 것을 - 튕겨 차단 용액을 제거하고 종이 타월로 플레이트를 두드려 우물에서 모든 차단 용액을 제거합니다.
- 세척액을 150μL의 세척액으로 플레이트를 3회 세척한 후 즉시 세척합니다.
- 25ul의 표준물질과 샘플을 단일 채널 피펫을 사용하여 웰의 하단 모서리에 추가합니다.
- 플레이트를 밀봉하고 800rpm에서 지속적으로 흔들면서 실온에서 4시간 동안 플레이트를 배양합니다.
- 비표지 검출 항체
- 다클론 토끼 항-MeCP2 항체를 얼음 위에서 해동합니다. 항체를 분석 희석액에 1:6,000으로 희석합니다.
- 표준물질과 샘플을 쓰레기통에 튕겨 넣고 종이 타월로 접시를 두드려 제거합니다.
- 세척액을 150μL의 세척액으로 플레이트를 3회 세척한 후 즉시 세척합니다.
- 멀티채널 파이펫터를 사용하여 각 웰에 25μL의 라벨링되지 않은 검출 항체를 추가합니다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 800rpm으로 계속 흔들면서 1시간 동안 배양합니다.
- 특이 접합 항체
- 냉장고에서 특정 2차 항체(Table of Materials)를 꺼내 얼음 위에 올려주세요. 항체 1:666.67을 분석 희석액에 희석하고 부드럽게 혼합합니다.
- 표지되지 않은 무료 2차 항체를 쓰레기통에 튕겨 넣고 종이 타월로 플레이트를 두드려 제거합니다.
- 세척액을 150μL의 세척액으로 플레이트를 3회 세척한 후 즉시 세척합니다.
- 멀티채널 피펫터를 사용하여 각 웰에 25μL의 특이 복합 항체(Table of Materials)를 추가합니다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 800rpm으로 계속 흔들면서 1시간 동안 배양합니다.
- 접시 읽기
- 유리 접합 항체(Table of Materials)를 쓰레기통에 튕겨 제거하고 종이 타월로 플레이트를 두드립니다.
- 150μL의 세척액으로 플레이트를 3회 세척합니다.
- 150μL의 1x Tris-based Gold read buffer(Table of Materials)를 광 생성을 위한 보조 반응물로 트리프로필아민을 포함하는 계면활성제와 함께 플레이트에 추가합니다. 역 피펫팅 기법을 사용하여 기포를 피하십시오.
- 플레이트를 마이크로플레이트 감지 플랫폼(Table of Materials)에 놓고 즉시 측정을 시작합니다. 96웰 플레이트 획득을 위한 설정을 사용합니다.
- 전기화학발광 검출 시스템(Table of Materials)에 내장된 CCD 카메라로 전기화학발광 신호를 캡처하고 RLU(상대 조명 단위)에 해당하고 빛의 강도에 정비례하는 신호 수를 기록합니다.
메모: 전기화학적 자극이 가해지면 탄소 전극에 결합된 루테늄 라벨은 620nm의 발광을 방출합니다. 기기와 함께 제공되는 소프트웨어(Table of Materials)로 데이터를 분석합니다.
표 1: 0 - 1,800ng/mL의 표준 시리즈.
| 표준 | 농도 | 희석 |
| 기준 1 | 1,800ng/mL | 1.08 μL 표준 원액 + 148.92 μL 용해 버퍼 |
| 기준 2 | 600 ng / mL | 50 μL 표준물질 1 + 100 μL 용해 버퍼 |
| 기준 3 | 200ng/mL | 50 μL 표준물질 2 + 100 μL 용해 버퍼 |
| 기준 4 | 66.67 ng / mL | 50 μL 표준물질 3 + 100 μL 용해 버퍼 |
| 기준 5 | 22.22 ng / mL | 50 μL 표준물질 4 + 100 μL 용해 버퍼 |
| 기준 6 | 7.41ng/mL | 50 μL 표준물질 5 + 100 μL 용해 버퍼 |
| 기준 7 | 2.47 ng / mL | 50 μL 표준물질 6 + 100 μL 용해 버퍼 |
| 기준 8 | 0.82ng/mL | 50 μL 표준물질 7 + 100 μL 용해 버퍼 |
| 기준 9 | 0.27ng/mL | 50 μL 표준물질 8 + 100 μL 용해 버퍼 |
| 기준 10 | 0 ng / mL | 150μL 용해 완충액 |