바이러스 게놈을 정량화하기 위한 Dot Blot Assay

참고: 이 프로토콜에 필요한 솔루션 및 버퍼에 대한 레시피는 표 1에 나와 있습니다.

1. 도트 블롯

1. 플라스미드 DNA 표준물질 준비
   1. AAV 벡터 게놈 플라스미드 DNA를 물 또는 Tris-HCl 완충액(10mM, pH 8.0)에서 10ng/μL로 희석합니다. 이 희석액 25 μL를 취하고 적절한 제한 효소로 1 시간 동안 절단하여 50 μL.
      의 반응 부피로 플라스미드 DNA를 선형화합니다. 메모: 우리는 복제된 분해 세트를 만듭니다(1.4.1단계 참조). 적절한 효소는 플라스미드 DNA를 도트 블롯 프로브 결합 영역 외부로 절단하는 효소여야 합니다. 편의상 희석된 플라스미드 DNA를 분주(25 μL/tube)하여 -20°C에서 냉동 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다. 5.1단계에서 튜브가 흔들리는 동안 플라스미드 DNA를 소화합니다. 플라스미드 DNA 표준물질을 과도하게 소화하지 마십시오.
   2. 분해된 플라스미드 DNA 표준물질이 들어 있는 튜브에 450μL의 물 또는 TE를 넣고 완전히 혼합합니다. 이 혼합물 70 μL를 1,330 μL의 물 또는 TE가 있는 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 희석된 플라스미드 표준물질(25 pg/μL)을 만듭니다.
   3. 표 1에 따라 2배 연속 희석 세트(600μL/튜브)를 만듭니다. 5초 동안 와류로 희석액을 완전히 혼합합니다.
2. 표준물질 및 바이러스 DNA 샘플의 변성
   1. 각 표준물질 희석액에 600μL의 2x 알칼리 용액을 추가합니다. 5-10초 동안 볼텍싱하여 잘 섞습니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다.
   2. 각 바이러스 DNA 샘플에 120μL의 2x 알칼리 용액을 추가합니다. 5-10초 동안 볼텍싱하여 잘 섞습니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다.
3. 도트 블로트 장치 설정
   1. 가위를 사용하여 블로팅(예: zeta-probe) 멤브레인을 샘플 수와 표준물질에 적합한 크기로 자릅니다. 멤브레인을 도트 블롯 장치에 놓기 전에 멤브레인을 물에 10분 동안 담그십시오. 멤브레인 장치에서 사용하지 않는 웰을 덮습니다.
      메모: 깨끗한 핀셋으로 멤브레인을 다루십시오. 빈 우물을 덮기 위해 멤브레인과 함께 제공되는 밝은 파란색 보호 시트를 사용할 수 있습니다. 시료 및 표준물질을 결합하기 전에 멤브레인이 건조되지 않도록 하십시오. 장치의 조립 및 사용에 대한 자세한 내용은 사용 설명서를 참조하십시오.
   2. 샘플이 적재될 우물에 물을 추가합니다. 진공을 적용하고 우물을 통해 물을 끌어당겨 오류를 확인하고 수정되면 다시 테스트하십시오. 단단히 밀봉되도록 진공 청소기를 적용하는 동안 나사를 다시 조입니다.
      메모: 불완전한 밀봉은 웰 사이의 샘플 누출을 유발할 수 있습니다.
   3. 물이 완전히 빠져나오면 진공을 완전히 해제합니다(즉, 진공 매니폴드가 공기 압력에 노출되어 있어야 함).
4. 표준물질 및 샘플을 dot blot 장치에 loading
   각
   1. 웰에 400 μL의 희석된 플라스미드 DNA 표준물질을 적용하고 4개의 표준물질 희석액을 실행합니다. 표준 다이제스트의 두 개의 개별 부분 표본을 사용하고 각각을 복제하여 로드합니다. 각 바이러스 DNA 샘플의 200μL/웰을 적용합니다.
      메모: 나머지 ~40 μL의 변성 샘플을 사용하여 희석된 샘플을 준비하고(예: 20 μL의 샘플과 1x 알칼리성 용액 180 μL를 사용하여 10배 희석된 샘플) 필요한 경우 블롯팅할 수 있습니다.
   2. 부드러운 진공 청소기를 적용하여 DNA 용액을 well을 통해 끌어당깁니다.
      메모: 진공 압력은 진공 압력이 도트 블롯 장치와 대기에 적용되도록 3방향 밸브를 부분적으로 열어 조정해야 합니다(즉, 스톱콕 암이 약 45° 각도로 배치되어 더 큰 흡입 소음을 내는 경우).
   3. 모든 웰이 비워지면 3방향 밸브를 조정하여 진공을 해제합니다. 표준물질과 샘플이 포함된 각 웰에 400μL의 1x 알칼리 용액을 추가합니다. 우물을 비우기 위해 진공 청소기를 다시 적용하기 전에 5분 동안 기다리십시오.
   4. 같은 방법으로 진공 청소기를 다시 적용합니다.
   5. 진공 상태에서 도트 블롯 장치를 분해하고 멤브레인을 제거한 다음 2x SSC로 헹굽니다. 깨끗한 종이 타월에 멤브레인을 올려 DNA 결합 면이 위를 향하도록 하여 과도한 2x SSC를 제거합니다.
   6. 적절한 UV 가교제를 사용하여 블로트된 DNA를 멤브레인에 UV 가교결합시킵니다. 멤브레인은 이제 혼성화를 위한 준비가 되었습니다.
      메모: UV 가교에 습식 멤브레인을 사용할 수 있습니다. 건조된 UV 가교 멤브레인은 실온에서 보관할 수 있습니다. 자세한 내용은 재료 표에서 확인할 수 있습니다.

2. 혼성화 및 세척

1. Hybridization Buffer를 65°C 수조에서 예열합니다.
2. DNA 프로브에 방사성 ^α-32P dCTP를 효소로 라벨링하고 제조업체의 권장 사항에 따라 시중에서 판매되는 키트를 사용하여 정제합니다.
   메모: 우리는 인핸서-프로모터 영역 또는 바이러스 게놈의 단백질 코딩 서열에서 0.5–2.0kb 길이의 프로브를 사용합니다. 이 프로토콜은 신호 감지를 위해 ³²개의 P 표지 방사성 프로브를 사용하지만, 비방사성 화학발광 또는 형광 프로브도 사용할 수 있습니다(논의 섹션 참조).
3. DNA가 결합된 면이 위로 향하게 하여 혼성화 병에 멤브레인을 넣고 5mL의 예열된 혼성화 버퍼로 멤브레인을 헹구고 버퍼를 폐기합니다. 그런 다음 예열된 혼성화 버퍼 10mL를 추가하고 65°C로 설정된 회전 혼성화 오븐에 병을 넣습니다.≥5분 동안 회전합니다.
4. 100°C로 설정된 열 블록에 튜브를 올려 20μL의 10mg/mL 전단 청어 또는 연어 정자 DNA 용액과 ³²P 표지 프로브(≥10^7cpm)를 5분 동안 열변성합니다. 그런 다음 얼음 위에서 ≥2분 동안 찰칵 식히고 잠시 회전한 다음 사용할 때까지 얼음 위에 두십시오.
   주의: 방사성 DNA 프로브의 경우 나사 캡과 O-링이 있는 1.5mL 튜브를 사용해야 합니다.
5. 변성된 정자 DNA와 방사성 프로브를 혼성화 병의 혼성화 버퍼에 빠르게 추가하고 병을 10초 동안 흔들어 혼합합니다. 병을 65°C 오븐에 다시 넣고 65°C에서 ≥4시간 동안 회전하면서 병을 배양합니다.
6. 혼성화가 완료되면 회전을 중지하고 혼성화 병을 제거한 다음 방사성 프로브 용액을 누출 방지 플러그 밀봉 캡이 있는 50mL 원추형 튜브에 붓습니다. 방사성 물질로 지정된 냉장고에 넣은 적절한 용기에 프로브를 보관하십시오.
   메모: 4°C에서 보관된 프로브와 함께 사용된 혼성화 완충액은 혼성화 완충액이 포함된 누출 방지 플러그 밀봉 캡이 있는 50mL 원추형 튜브를 100°C 수조에 5분 동안 배치하여 5회 이상 재사용할 수 있습니다.
7. 65°C로 가열된 세척 버퍼로 멤브레인을 세척합니다. 혼성화 병에 20-30mL의 세척 버퍼를 추가하고 5분 동안 회전합니다. 이 세척을 2회 더 반복합니다.
   메모: 세척 용액의 방사능을 측정하고 지역 기관에서 요구하는 경우 기록합니다.
8. 멤브레인을 세척하는 동안 이미지 지우개에 형광체 이미징 스크린을 5분 동안 놓습니다.
9. 세 번째 세척 후 혼성화 병에서 멤브레인을 제거하고 종이 타월로 멤브레인의 초과 버퍼를 제거한 다음 멤브레인을 투명한 플라스틱 종이 홀더에 넣습니다. 가이거 계수기를 사용하여 멤브레인의 방사성 신호를 확인합니다. 신호 강도에 따라 지워진 형광체 이미징 스크린을 10분에서 하룻밤 동안 멤브레인에 노출시킵니다.
10. 형광체 이미지 스캐닝 시스템을 사용하여 화면을 스캔하고 각 점의 신호 강도에 대한 데이터를 얻습니다.

표 1: 정량적 도트 블롯 플라스미드 DNA 표준물질.2배 연속 희석(600 μL/튜브)으로 플라스미드 DNA 표준물을 준비하기 위해 필요한 25 pg/μL 플라스미드 DNA 표준물 용액 및 물 또는 TE의 부피가 표시되어 있습니다. 플라스미드 DNA 표준물질 열의 숫자(0.039 - 5 ng)는 각 플라스미드 DNA 표준물질 용액 200 μL에 포함된 DNA의 양입니다.