조직 용해물에서 표적 단백질을 추정하기 위한 정량적 점 블롯

초록

출처: Qi, X., et al. 높은 처리량, 정량적 도트 블롯 분석(QDB)을 사용하여 조직 수준에서 선택한 단백질의 함량에 대한 절대 측정. J. Vis. 특급 (2018).

이 동영상은 조직 샘플에서 관심 단백질의 절대 정량화를 위한 정량적 점 블롯(QDB) 기술을 보여줍니다. 샘플의 단백질은 QDB 플레이트의 웰 내부에 있는 니트로셀룰로오스 멤브레인에 고정되어 있습니다. 과산화효소(peroxidase enzyme)로 표지된 표적 단백질 특이적 항체를 활용하여 화학발광 기질을 산화시켜 빛을 생성하고, 이 광을 측정하여 시료의 단백질 농도를 측정합니다.

프로토콜

1. 샘플 준비

1. 50mg의 마우스 조직을 1.5mL 튜브에 넣습니다. 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제(100mM NaF, 0.1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드, 5μg/mL 펩스타틴, 10μg/mL 유펩틴, 5mM EGTA, 1mM EGTA, 1mM MgCl₂, 10mM Na_2P2O7, 1% Triton X-100, 10% 글리세롤)를 추가합니다. 5 μg/mL 아프로티닌).
2. 얼음 위에서 1분 동안 균질화기로 조직을 균질화합니다.
3. 4°C에서 8,000 x g에서 10분 동안 원심분리기.
4. 상층액을 새 튜브(1.5mL)에 모으고 BCA 키트를 사용하여 단백질 농도 분석을 위해 1μL를 꺼냅니다.
   참고: 웨스턴 블롯 분석 및 도트 블롯 분석에 일반적으로 사용되는 모든 용해 버퍼를 QDB 분석에 사용할 수 있습니다.

2. 항체의 특이성 결정

1. 웨스턴 블롯 분석을 위해 섹션 1.4, IgG가 없는 BSA(20μg) 및 표준 단백질(600pg)의 샘플 용해물(20μg)을 준비합니다.
   참고: IgG가 없는 BSA는 음성 대조군으로 사용되며 표준 단백질은 양성 대조군으로 사용됩니다. 항체의 특이성은 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 올바른 크기의 밴드 하나를 보여줌으로써 입증됩니다.

3. QDB 분석의 선형 범위 정의

1. 표준 단백질을 ddH₂O로 용해시키고 단백질을 1,200pg/μL의 농도로 희석합니다.
2. 준비된 샘플에서 농축된 단백질을 섹션 1.4 - 4 μg/μL로 희석합니다.
3. BSA를 ddH₂O로 용해시킵니다.단백질을 1,200pg/μL 및 4μg/μL의 농도로 희석합니다.
4. 표준 단백질 및 준비된 샘플의 일련의 희석액을 표 1 및 표 2의 안내에 따라 준비했습니다.
5. 10μL 희석 표준 단백질 또는 희석 준비 샘플과 10μL 2x 로딩 버퍼(120mM Tris-HCl pH 6.8, 20% 글리세롤, 4% SDS, 0.2% 브롬페놀 블루, 200mM DTT)를 함께 혼합합니다.
6. 혼합물을 85°C에서 5분 동안 가열합니다.

4. QDB 분석 프로세스

1. 샘플 응용 프로그램
   1. 플레이트 바닥이 테이블 표면에 닿지 않도록 QDB 플레이트를 지지합니다. 예를 들어, 빈 피펫 팁 상자를 지지대로 사용하십시오.
   2. 최대 2 μL의 샘플을 QDB 플레이트의 개별 장치 하단에 있는 멤브레인 중앙까지 로드합니다.
2. 접시 말리기
   1. 로드된 QDB 플레이트를 실온(RT)에서 1시간 동안 그대로 두거나 대안으로 로드된 플레이트를 환기가 잘 되는 공간에서 37°C에서 15분 동안 그대로 두십시오.
3. 플레이트 막기
   1. QDB 플레이트를 전달 버퍼(0.039M 글리신, 0.048M 트리스, 0.37% SDS, 20% 메틸 알코올)에 담그고 플레이트를 10초 동안 부드럽게 흔듭니다.
   2. QDB 플레이트를 TBST(Tris-buffered saline, 0.1% Tween 20)로 3회 부드럽게 헹군 다음 TBST에서 지속적으로 흔들면서 5분 동안 플레이트를 세척합니다.
   3. 지속적인 흔들림으로 1시간 동안 차단 버퍼(TBST(100μL/well)의 5% 무지방 우유)로 QDB 플레이트를 막습니다.
4. 1차 항체 배양
   1. 차단 완충액의 1차 항체를 선택한 농도(1:500에서 1:5,000까지)로 희석하고 일반 96-well 플레이트의 각 개별 well에 100μL를 추가합니다. QDB 플레이트를 96웰 플레이트에 삽입하고 결합된 플레이트를 RT에서 2시간 동안 또는 4°C에서 밤새 지속적으로 흔들어 배양합니다.
   2. 또는 QDB 플레이트를 상자 안에 넣고 전체 플레이트에 동일한 항체가 사용되는 경우 플레이트의 멤브레인 부분 위 2-3mm 위의 차단 버퍼로 상자를 채웁니다. 선택한 농도의 1차 항체를 추가하고 RT에서 2시간 동안 또는 지속적인 진탕 하에 4°C에서 밤새 플레이트를 배양합니다.
   3. TBST로 플레이트를 세 번 헹구기 전에 TBST로 세 번 씻고 매번 5분 동안 계속 흔듭니다.
5. 2차 항체 배양
   1. 2차 항체를 차단 완충액에 있는 2차 항체를 선택한 농도(1:1,000 - 1:50,000)로 희석하고, 100μL/웰을 96웰 플레이트 또는 섹션 4.4.2에 설명된 대로 상자에 분취한 다음 로드된 96웰 플레이트 또는 상자 내부에서 QDB 플레이트를 일정한 쉐이킹으로 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
   2. TBST로 QDB 플레이트를 3회 부드럽게 헹군 다음 TBST로 각각 5분씩 지속적으로 흔들면서 플레이트를 3회 세척합니다.
6. 부량
   1. 제조업체의 지침에 따라 향상된 화학발광 기질(ECL)을 준비합니다.
   2. ECL 기질을 96웰 플레이트(100μL/웰)에 분취하고 QDB 플레이트를 96웰 플레이트 내부에 2분 동안 지속적으로 진탕합니다.
   3. 96웰 플레이트에서 QDB 플레이트를 제거하고 짧게 흔들어 여분의 액체를 제거합니다. 플레이트를 흰색 마이크로타이터 플레이트에 놓습니다.
   4. 마이크로플레이트 리더를 켜고 사용자 인터페이스에서 "플레이트가 있는 플레이트"를 선택한 후 결합된 플레이트(QDB 플레이트 + 화이트 플레이트 어댑터)를 정량화를 위해 마이크로플레이트 리더 내부에 배치합니다.
      알림: 플레이트의 간섭을 방지하기 위해 흰색의 불투명한 마이크로타이터 플레이트를 어댑터로 사용해야 합니다. 결합된 플레이트(QDB 플레이트 + 96웰 플레이트 어댑터)를 마이크로플레이트 리더 내부에 배치할 때 기계가 걸리지 않도록 "덮개가 있는 플레이트"를 선택해야 합니다.

표 1. 표준 단백질 곡선을 위한 희석 계획.

님 년 분 의 의 분 분 년 분 의 의 의 의 의 의

	S1 (0pg/μl)	S2 (33.3pg/μl)	S3 (100pg/μl)	S3 (300pg/μl)	S5 (600pg/μl)	S6 (1200pg/μl)
표준 단백질(1200pg/μl)	0	1.39	4.17	12.5	25	50
IgG-free BSA (4pg/μl)	50	48.61	45.83	37.5	25	0
합계	50	50	50	50	50	50

표 2. 준비된 샘플에 대한 희석 계획

년 분 분 의 의 년 분 년 분 의 의 의 의 의 의

	X1 (0μg/μl)	X2 (0.25μg/μl)	X3 (0.5μg/μl)	X4 (1μg/μl)	X5 (2μg/μl)	X6 (4 μg/μl)
시료(4μg/μl)	0	3.125	6.25	12.5	25	50
IgG가 없는 BSA(4μg/μl)	50	46.875	43.75	37.5	25	0
합계	50	50	50	50	50	50

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마이크로플레이트 리더	테칸	테칸 인피니트 200 프로
QDB 플레이트	옌타이 제스턴 Co.Ltd		플레이트는 이메일 또는 방문 www.zestern.net 를 통해 확인 목적으로 요청 시 제공됩니다.
Peroxidase AffiniPure 당나귀 안티 토끼 IgG (H + L) (최소 X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)	잭슨	전화: 711-035-152
향상된 화학발광 기판	열	32134
토끼 안티 CAPG	시노바이오로직스	14213-T52
CAPG 단백질	시노바이오로직스	14213-HNAE
헤페스	시그마	H4034
염화나트륨	천진 Ruiji Jin 특수 화학 유한	10461220
마그네슘Cl2	천진 Zhiyuan 화학 시약 Co., Ltd	20120802
에디타	시그마	E9884-500G
에그타	시그마	BNN1913
나2P2O7	하이퉈 한의학 검사	20160914
트리톤 X-100	시그마	T9284
글리세롤	시그마	G7757
페닐메틸설포닐 플루오라이드	시그마	P7626-5G
펩스타틴	시그마	Z290033
루펩틴	시그마	엘2884
아프로티닌	시그마	A3428
트리스 - HCl	시그마	T6455
증권 시세	시그마	L5750-500지
디티(DTT)	시그마	43815-1지
브롬페놀 블루	시그마	나-0126
나에프	시그마	S7920

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