단백질 발현 수준을 추정하기 위한 정량적 웨스턴 블로팅(Quantitative Western Blotting)

초록

출처: Huang, Y. T., et al. 표준화된 정량적 웨스턴 블로팅을 사용하여 조직 및 발달 전반에 걸쳐 단백질 수준을 강력하게 비교합니다. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 샘플에서 표적 단백질 발현을 정량화하기 위한 전체 단백질 정규화 기반 웨스턴 블로팅 기술을 보여줍니다. 샘플의 총 단백질 염색을 활용하여 비율계량 분석을 수행하여 표적 단백질의 상대적 발현 수준을 결정합니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜은 재현성을 높이기 위해 표준화된 상용 키트 및 시약을 사용하여 최적화되었습니다(재료 표 참조).

1. 샘플 준비

1. 단백질 추출
   1. -80°C의 세포 또는 조직 샘플을 드라이아이스에 담아 옮기고, 얼음에서 해동한 후 필요에 따라 얼음처럼 차가운 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다. 불필요한 동결-해동 주기는 단백질 품질에 영향을 미치므로 피하십시오.
   2. 조직 중량당 최적의 양을 사용하여 각 샘플에 25x 프로테아제 억제제를 포함하는 방사성 면역침전 분석(RIPA(150mM Tris-HCl(pH 7.6), 1mM NaCl, 1% NP-40, 1% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS)를 추가합니다
      메모: 응용 분야에 따라 균질화 버퍼의 유형과 양은 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.
   3. 폴리프로필렌 유봉이 있는 휴대용 전기 균질화기를 사용하여 조직 샘플을 균질화합니다. 각 샘플 사이에서 유봉을 이중 증류수로 씻고 깨끗한 티슈로 말리십시오. 다양한 실험 조건과 조직 사이에서 유봉을 변경합니다.
   4. 균질화 후 10분 동안 샘플을 얼음에 그대로 두십시오. >10,000 x g, 4°C에서 10분 동안 시료를 원심분리합니다.
   5. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 얼음 위의 새 튜브로 옮깁니다. 상등액은 단백질 샘플입니다. 추출된 단백질을 -80°C에서 보관하거나 단백질 농도를 직접 측정합니다.
2. 단백질 농도의 정량화 및 정규화
   1. 비신초닌산(BCA) 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. 웰당 200μL의 BCA 혼합물을 사용하여 96웰 광학 플레이트에서 제조업체의 지침에 따라 BCA 분석 혼합물을 준비합니다.
      메모: Lowry 및 Bradford 분석과 같은 다른 정량 방법도 단백질 농도가 실험 전반에 걸쳐 일관되게 정량화되는 한 단백질 농도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
   2. 소 혈청 알부민(BSA) 표준물질을 증가하는 농도로 3회씩 준비하고 각 단백질 샘플 1μL를 복제하여 첨가합니다. 단백질 농도가 낮을 것으로 예상되는 경우 60°C에서 10분 이상 예열된 가열 블록에서 96웰 플레이트를 배양합니다.
   3. 배양 후 플레이트 리더를 사용하여 560nm에서 흡수를 측정합니다.
   4. 플레이트 리더 측정값을 내보내고 각 샘플의 평균 흡광도 값을 단백질 표준물질을 사용하여 얻은 표준 곡선과 비교하여 단백질 농도를 계산합니다. 표준 곡선의 R-제곱 값은 샘플 단백질 농도를 정확하게 추정하기 위해 0.98 이상이어야 합니다.
   5. 샘플 버퍼와 초순수에 단백질 샘플의 희석액을 준비하여 단백질의 양을 정규화합니다. 총 부피는 사용하는 젤의 종류에 따라 조정할 수 있습니다. 레인당 30μg의 단백질을 시작량으로 로드하는 것이 좋습니다. 필요에 따라 각 샘플에 디티오트레이톨(DTT, 최종 농도 5mM) 또는 베타-메르캅토에탄올(최종 농도 200mM)과 같은 환원제를 추가합니다. 흄 후드에 희석되지 않은 베타-메르캅토에탄올을 피펫으로 넣었습니다.
   6. 샘플을 70°C의 가열 블록에서 10분 동안 배양합니다. 샘플을 얼음, 소용돌이에 놓고 잠시 회전시켜 수집합니다. 젤을 넣을 때까지 얼음에 보관하십시오.

2. 단백질 샘플의 겔 전기영동

1. 장치 및 젤 설정
   1. 겔 전기영동 챔버 시스템에서 프리캐스트 4–12% Bis-Tris 그래디언트 겔(재료 표 참조)을 설정합니다. 사용하기 전에 이중 증류수를 사용하여 젤을 헹굽니다.
      참고: 관심 단백질의 크기, 상호 작용 및 풍부도에 따라 구배, 완충제 또는 웰 크기와 수가 다른 겔을 사용할 수 있습니다.
   2. 탱크당 이중 증류수에 희석된 500mL의 1x MES SDS 러닝 버퍼를 추가합니다. 스태킹 젤의 웰을 방해하지 않고 러닝 버퍼를 추가한 후 젤에서 빗을 조심스럽게 제거합니다.
2. 단백질 로딩
   1. 3.5μL의 단백질 표준물질을 웰에 로드합니다. 샘플 레이아웃에 따라 겔의 양쪽에 단백질 래더를 로드하면 단백질 크기를 보다 정확하게 추정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 보다 정확한 시료 주입을 위해 끝이 미세한 젤 주입 팁을 사용하십시오.
   2. 멤브레인 간 정규화를 위한 내부 표준물질을 사용하는 경우(아래 5단계 및 논의 참조) 다른 샘플과 동일한 양을 단백질 ladder 옆의 처음 3웰에 로드합니다.
   3. 나머지 웰에 각 샘플 30μg을 로드합니다. 모든 빈 웰에 1x 샘플 버퍼를 추가합니다.
3. 전기영동
   1. 샘플을 적재한 후 젤 탱크를 조립합니다. 80V에서 10분 동안 스태킹 젤을 통해 샘플을 실행한 다음 추가로 45-60분 동안 150V를 실행합니다.

3. 단백질 전달

참고: 이 프로토콜의 단백질 전달은 빠르고 일관된 결과를 위해 상업적으로 이용 가능한 반건조 블로팅 시스템(재료 표 참조)을 사용하여 수행됩니다.

1. 여과지를 이중 증류수에 미리 담그고 젤 나이프, 플라스틱 파스퇴르 피펫, 블로팅 롤러 및 집게를 사용할 준비가 되었는지 확인하여 단백질 전달을 준비합니다.
2. 모든 포장 호일을 조심스럽게 제거하여 전사 스택을 엽니다. 하단 스택에서 상단을 제거하고 따로 보관하십시오. 하단 스택의 멤브레인을 전기영동 러닝 버퍼(2-3mL) 몇 방울로 빠르게 적십니다. 전사 스택이 열리면 PVDF 멤브레인이 건조되는 것을 방지하는 것이 중요합니다.
3. 전기영동을 중단한 후 겔 나이프를 사용하여 프리캐스트 겔을 열고 스태킹 겔을 잘라냅니다. 젤의 가장자리를 잘라 플라스틱 주물에서 벗어납니다. 젤 나이프가 손상되지 않도록 젤 나이프를 젖은 상태로 유지하십시오.
4. 전사 스택을 아래에서 위로 조립합니다: 하단 스택(PVDF 멤브레인 포함), 단백질 겔 및 여과지. 블로팅 롤러를 사용하여 모든 기포를 제거합니다. 여과지 위에 상단 스택을 놓고 스택을 다시 굴려 기포를 제거합니다. 단백질 전달 중에 겔이 변형될 수 있으므로 너무 세게 누르지 마십시오.
5. 장치의 왼쪽에 전극이 있는 전체 스택을 전송 장치로 옮기고 스택 위에 젤 스폰지를 놓아 장치의 해당 전기 접점과 정렬되도록 합니다. 덮개를 닫고 적절한 프로그램을 선택한 다음 시작합니다(20분 동안 7V가 권장 시작점입니다).
6. 완료되면 스택이 식고 멤브레인이 건조되는 것을 방지하기 위해 2분 동안 뚜껑을 닫은 상태로 두십시오. 전사 스택을 제거하고 멤브레인을 겔 크기로 자릅니다. 총 단백질 염색을 계속하기 전에 절단된 멤브레인을 이중 증류수로 빠르게 세척하십시오.

4. 총 단백질 염색

참고: 형광 검출을 사용하면 선형 범위와 감도를 훨씬 더 잘 제어할 수 있으므로 기존 접근 방식(예: ECL 검출)에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 따라서 4단계 및 5단계에서는 형광 TPS 및 형광 2차 항체를 사용합니다(재료 표 참조).

1. 단백질 면이 안쪽을 향하도록 하여 멤브레인을 50mL 튜브에 굴립니다. 형광 TPS와 2차 항체의 빛에 민감하기 때문에 모든 후속 단계는 어둠 속에서 수행됩니다.
2. 단백질 염색 용액 5mL(재료 표 참조)를 추가하고 실온에서 5분 동안 롤러에서 배양합니다. TPS 및 세척 버퍼에는 메탄올이 포함되어 있으므로 흄 후드에서 이러한 단계를 수행하십시오.
3. 염색 용액을 버리고 5mL의 세척 용액(30% 메탄올 중 6.3% 아세트산)으로 빠르게 두 번 세척합니다. 세척 단계 사이에 튜브를 롤러에 잠시 다시 놓습니다. 계속하기 전에 초순수로 멤브레인을 잠시 헹굽니다.

5. 차단, 항체 배양 및 검출

1. 멤브레인 차단: 멤브레인이 들어 있는 50mL 튜브에 3mL의 차단 버퍼(재료 표 참조)를 추가합니다. 실온에서 30분 동안 롤러에 멤브레인을 배양합니다. 항체의 선택에 따라 사용되는 차단 버퍼의 유형에 최적화가 필요할 수 있습니다.
2. 1차 항체 배양
   1. 차단 버퍼를 폐기하고 적절하고 최적화된 농도의 1차 항체로 교체합니다(그림 1 및 그림 2: mouse-anti-SMN, 1:1,000, 차단 완충액에 희석됨).
      메모: 1차 항체의 적절한 최적화에는 항체가 적절한 크기의 단백질 산물을 검출하는 동시에 다른 비특이적 단백질 산물에 대한 결합이 없거나 최소한인지 확인하는 것이 포함되어야 합니다. 가능한 경우 관심 단백질에 대해 여러 항체를 테스트하고 비교합니다.
   2. 멤브레인을 롤러에 담아 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 항체 용액을 제거하고 실온(RT)에서 롤러에 1x PBS로 5분 동안 6회 세척합니다.
3. 2차 항체 배양
   1. 5mL 차단 완충액에서 1차 항체의 숙주에 대해 1:5,000으로 특정 2차 항체를 준비합니다. 다른 2차 항체는 다른 희석 또는 대체 차단 완충액의 사용이 필요할 수 있습니다.
   2. 2차 항체 용액이 포함된 멤브레인을 롤러에 올려 RT에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 롤러에 1x PBS로 30분 동안 멤브레인을 세 번 세척합니다.
   3. 멤브레인을 건조시키고 감지될 때까지 알루미늄 호일을 사용하여 멤브레인을 빛으로부터 보호하십시오. 멤브레인은 장기 보관을 위해 4°C에서 보관할 수 있습니다.
4. 이미지 획득
   1. 스캐너에 연결된 컴퓨터에 로그인합니다. 단백질 면이 아래를 향하도록 스캐너에 멤브레인을 놓고 소프트웨어에서 스캔 영역을 선택합니다.
   2. 포화가 발생하지 않는지 확인하여 두 채널(700nm 및 800nm) 모두에 대한 레이저 강도를 최적화합니다. 두 채널 모두에서 이미지를 획득하고 추가 분석을 위해 이미지를 내보냅니다(6단계).

6. 웨스턴 블롯 분석 및 정량화

참고: 이 권장 사항은 무료로 사용할 수 있는 Image Studio 소프트웨어를 기반으로 합니다. 그러나 ImageJ와 같은 다른 소프트웨어 패키지를 사용하여 유사한 분석을 수행할 수도 있습니다.

1. 파일 가져오기: 분석에 사용되는 컴퓨터에 로컬 작업 공간을 만듭니다. 이것은 획득된 웨스턴 블롯에 대한 이미지 파일의 데이터베이스를 생성합니다. 스캐너에서 얻은 파일을 가져오고 분석할 이미지를 선택합니다.
2. TPS 분석
   1. 700nm 채널을 표시하여 총 단백질 염색 결과를 표시합니다. TPS 이미지의 예는 그림 1에 포함되어 있으며, 여기에는 신생아(P5)(그림 1A-B) 및 10주 된 마우스(그림 1C-D)의 다양한 조직이 직접 비교됩니다. 마찬가지로, 그림 2는 서로 다른 연령의 쥐의 뇌 조직을 직접 비교한 예를 보여줍니다.
   2. 오른쪽 상단 모서리에서 Analysis(분석) 탭을 선택하고 Add Rectangle(사각형 추가)을 선택하여 정규화를 위한 관심 영역을 정의합니다(그림 1B, D). 첫 번째 사각형 영역을 복사하여 각 개별 샘플에 붙여넣어 정의된 영역이 분석된 모든 레인에 대해 동일한 크기인지 확인합니다.
   3. 소프트웨어의 왼쪽 하단 모서리에 있는 모양 탭에서 결과를 복사합니다.
3. 수량화
   메모: 시료 정량화를 위한 최적의 접근법은 실험 설계에 따라 다릅니다. 여기에서는 시간이 지남에 따라 감소하는 것으로 알려진 생존 운동 뉴런 단백질(Smn, 신경근 질환인 척수성 근위축증에 관여하는 핵심 단백질)의 검출과 Smn 신호 강도를 TPS로 정규화하여 단백질 발현 발달에 대한 신뢰할 수 있는 추정치를 제공하는 방법에 대한 예시를 제공합니다.
   1. 그림 2는 TPS를 단백질 로딩 대조군으로 사용하는 동물의 연령이 증가함에 따라 Smn 발현이 감소하는 것을 보여줍니다. 6.2.1-6.2.3단계를 반복하여 단백질 로딩을 정량화합니다(그림 2B). 800nm 채널(그림 2A)에서 6.2.1-6.2.3단계를 반복하여 관심 단백질을 분석합니다.
   2. TPS와 관심 단백질의 결과를 스프레드시트 프로그램에 복사합니다. 스프레드시트에서 먼저 가장 높은 TPS 신호를 결정하고 각 TPS 신호 값을 이 값으로 나누어 정규화된 단백질 로딩 값을 구함으로써 단백질 로딩을 정규화합니다.
   3. 각 개별 샘플의 800nm 신호 값을 해당 정규화된 단백질 값으로 나누어 서로 다른 샘플의 상대적 단백질 발현 비율을 계산합니다.
   4. 첫 번째 정규화 후 다양한 시점 또는 조직을 내부 표준물질의 평균값과 비교하여 서로 다른 멤브레인 및 실험 간에 직접 비교할 수 있습니다.

결과

그림 1. 서로 다른 두 연령에서 마우스 조직의 TPS 및 Smn 단백질 수준을 보여주는 웨스턴 블롯.P5(A) 및 10주 된 (C) 마우스에 대한 TPS 및 Smn 단백질. (나, 디) 전체 레인 TPS의 형광 강도를 계산하고 (임의의 단위로) 표시합니다. M: 마커/단백질 표준물질; kDa: 킬로달톤; A.U.: 임의의 단위; P5: 산후 5일째; 10W: 10주.

그림 2. 서로 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Fine-tipped Gel 로딩 팁	알파 연구소	GL20057SNTL
Halt 프로테아제 억제제 칵테일, EDTA 프리 100x 5mL	써모피셔 사이언티픽	78437
휴대용 균질기	VWR 컬렉션	Tel.: 431-0100
iBlot 2 젤 전사 장치	써모피셔 사이언티픽	IB21001
iBlot 전사 스택, PVDF, 일반 크기	써모피셔 사이언티픽	IB401031
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NuPAGE MOPS SDS 러닝 버퍼(20X)	써모피셔 사이언티픽	NP0001
오디세이 블로킹 버퍼	라이코	927-40000
정제된 마우스 anti-SMN(survival motor neuron) 단클론 항체	BD 트랜스duction 연구소	610646	SMN/SMA 문헌에서 광범위하게 사용되며 로트 번호에 관계없이 일관된 결과를 제공합니다
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