세포 이질성을 결정하기 위한 Single-Cell Western Blotting

초록

출처: Wang, L., et al., 생체 내 단핵구 화학 요법 활성의 정량화 및 혈액 단핵구 유래 대식세포의 특성화. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 이종 현탁액의 단세포 웨스턴 블로팅 칩에 포착된 개별 세포의 구성을 식별하는 단세포 웨스턴 블로팅 기술을 설명합니다. 이 기술은 표적 세포에 특이적인 단백질 마커에 태그된 형광단의 형광 강도를 감지합니다.

프로토콜

1. scWB(Single-cell Western Blot) 분석을 사용하여 세포 현탁액의 세포 구성 결정

1. 사용하기 전에 페트리 접시에 15mL의 1x 현탁액 완충액을 넣고 실온에서 최소 10분 동안 scWB 칩을 재수화합니다.
2. 희석된 단일 세포 현탁액 1mL(10,000-100,000 cells/mL)를 재수화된 칩에 추가합니다. 표면을 10cm 페트리 접시의 바닥에 놓습니다. 표면이 평평하게 설정되었는지 확인하십시오.
3. 건조를 방지하기 위해 페트리 접시를 뚜껑으로 덮고 세포가 구배에 의해 5-15분 동안 가라앉도록 합니다.
4. 칩을 명시야 현미경 아래에 놓고 10배 배율로 웰을 검사합니다.
   메모: 마이크로웰의 약 15-20%는 단일 셀이 차지해야 하며, 웰의 2% 미만은 2개 이상의 셀을 포함해야 합니다.
5. 칩이 들어 있는 10cm 페트리 접시를 45도 기울입니다.
6. 1x 서스펜션 버퍼로 칩을 세척하여 칩의 상단에서 하단으로 부드럽게 피펫팅하여 칩 표면에서 포착되지 않은 세포를 제거합니다. 3회 반복합니다.
7. 단세포 서양 기구를 준비합니다.
8. 용해 시간, 전기영동 시간 및 UV 캡처 시간을 설정합니다. 기저막 유래 겔 플러그에서 회수된 모집된 대식세포를 분석하려면 다음 설정을 사용하십시오: 용해 시간: 0초; 전기 영동 시간 : 160 초; UV 캡처 시간 240초.
9. 단세포 서양 기기의 전기 영동 셀에 칩을 조심스럽게 로드하고 젤 측을 향하게 합니다. 칩의 젤 면이 손상되지 않도록 주의하십시오.
10. lysis/running buffer를 챔버에 붓고 전체 single-cell western chip을 완전히 덮습니다. 세포 용해를 시작합니다.
11. 1.8에 나열된 설정을 사용하여 scWB 기기를 실행합니다.
12. 실행이 완료되면 칩을 10cm 페트리 접시에 옮기고 RT에서 10분 동안 1x 세척 버퍼로 칩을 두 번 세척합니다.
13. 총 80μL의 항체 희석제(항체 1 8μL와 항체 2 8μL와 희석제 64μL 혼합)에 1차 항체(항빈쿨린: 1:10, 항-CD45: 1:15, 항-CD11b: 1:20, 항-F4/80: 1:10)
의 희석액을 준비합니다.
14. 80μL의 1차 항체 용액을 항체 프로빙 챔버에 추가하고 칩 젤 쪽을 아래로 내려 항체 용액이 칩을 가로질러 심지로 들어가도록 합니다.
15. RT에서 2시간 동안 기본 항체 용액으로 배양합니다.
16. 셰이커의 1x 세척 버퍼에 10분 동안 칩을 세 번 세척합니다.
17. 젤을 탈염시키기 위해 셰이커의 물에 칩을 10분 동안 한 번 씻습니다.
18. 총 80 μL 부피에서 2차 항체를 1:20 희석하여 준비합니다(2 μL의 2차 항체와 78 μL의 희석제 혼합).
19. 빛으로부터 보호된 RT에서 1시간 동안 2차 항체로 칩을 배양합니다.
20. 셰이커의 1x 세척 버퍼로 10분 동안 칩을 세 번 세척합니다.
21. 슬라이드 스피너를 사용하여 칩을 회전시켜 남아 있는 세척 버퍼를 제거합니다.
22. 이중 레이저 마이크로어레이 스캐너에서 5μm 해상도로 2차 항체에 결합된 형광단의 스펙트럼 채널에서 칩을 스캔합니다.
23. scWB 전용 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석할 수 있습니다.

2. scWB 칩 제거

1. 스캔한 칩을 벗겨낼 준비가 될 때까지 세척 버퍼에 보관하십시오.
2. 흄 후드에 수조를 놓습니다.
3. 50mL 튜브 랙을 랙에서 불과 1cm 높이의 물로 수조에 놓고 수온을 60°C로 설정합니다.
4. 스트리핑 버퍼를 준비합니다. 스트리핑 버퍼 용액 1L의 경우 증류수 9.85mL에 Tris-HCl(pH 6.8) 20g과 SDS 900g을 용해하고 pH를 조정합니다. 그런 다음 증류수를 1L로 채웁니다. 매번 사용하기 직전에 0.8%(β-메르캅토에탄올, β-ME, 14.3M)를 추가합니다.
5. 초기 스캔 후 벗기기 전에 칩을 10cm 페트리 접시에 넣습니다.
6. 각 칩에 대해 40mL의 스트리핑 버퍼를 취하고 320μl의 β-ME.
   를 추가합니다. 주의 : β-ME는 독성이 있으며 인간과 환경에 유해합니다. 다음 절차는 흄 후드에서 수행해야 합니다.
7. 칩을 캐니스터에 넣고 캐니스터로 물이 새는 것을 방지하기 위해 파라필름으로 캐니스터를 밀봉합니다.
8. 예열된 수조의 튜브 랙 내부에 캐니스터를 놓습니다.
9. 90분 동안 배양합니다.
10. 캐니스터에서 칩을 조심스럽게 제거하고 신선한 페트리 접시에 넣습니다.
11. 1x 세척 버퍼로 칩을 한 번 간단히 세척합니다. 그런 다음 페트리 접시에 15mL의 1x 세척 버퍼를 추가합니다.
12. 셰이커에서 칩을 15분 동안 씻습니다. 세척 단계를 네 번 반복합니다.
    메모: 칩은 다음 1차 항체를 사용할 준비가 되었습니다(1.12 - 1.21 단계 참조).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10cm 페트리 접시	그리너 바이오 원	664 160
10x 서스펜션 버퍼	단백질심플	R101
15cm 페트리 접시	송골매	353025
2-메르캅토에탄올	MP 바이오메디컬	2194705
5% 세탁 버퍼	단백질심플	R252
항체 희석제	단백질심플	042-203
벤치 탑 원심분리기	벡크만 쿨터		마이크로퓨지 22R 원심분리기
소 세럼 알부민	시그마-알드리치	A7906-100G
칼세인 AM	써모피셔	C3099 (영문	1 mL
CD11b	Novus 생물학적 제제	NB110-89474
CD45 (D4H7K) 토끼 mAb	세포 신호 기술	727987S
CD68/SR-D1 (FA-11)	Novus 생물학적 제제	NBP2-33337SS
셀로미터 비전	넥셀롬
디스플레이	BD (영어)	354235	100 밀리리터
해부 가위
당나귀 항토끼 IgG 2차 항체 [NL557]	Novus 생물학적 제제	NL004	NL 557 콘주게이트
당나귀 항쥐 IgG (H+L) 2차 항체 [DyLight 650]	Novus 생물학적 제제	NBP1-75655	DyLight 650 콘주게이트
F4/80 (CI-A3-1)	Novus 생물학적 제제	NB600-404SS
히트 블록	에펜도르프	22331	써모믹서
Lysis/Running 버퍼	단백질심플	R200
Matrigel Matrix (성장 인자 감소)	BD (영어)	제354230	10 밀리리터
마이크로어레이 스캐너	퍼킨엘머	스캔 어레이 Gx
마이크로 원심분리기 튜브	피셔 사이언티픽	전화: 05-408-129
현미경	써모피셔	에보스 fl
마일로	단백질심플		단일 셀 웨스턴
바늘	BD (영어)	305111	26 지
파라필름
프로빙 챔버	단백질심플	제035-020
재조합 마우스 CCL2/JE/ MCP-1 단백질	R&D	제479-JE-050
scWEST 칩	단백질심플	C300
셰이 커	바이오익스프레스		유전자 메이트 오비탈 쉐이커
단일 셀 웨스턴 칩 캐니스터	단백질심플	제035-118
슬라이드 스피너	랩넷	C1303-T
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)	피셔 사이언티픽	BP 166-500
주사기	BD (영어)	309602	1 mL
트리스-하이드로클로라이드	피셔 사이언티픽	BP 153-500
트위터	단백질심플	제035-020
수조	써모피셔

호 호 ) (영어) 시리즈 호 호 시리즈 호 (영문) (영문) 호