단백질 가공을 위한 화학발광 웨스턴 블롯 분석

초록

출처: Hillert-Richter, L. K. et al., 이 복합체에서 CD95 죽음을 유도하는 신호 복합체의 조성 및 프로카스파제-8 처리 측정. J. Vis. 특급. (2021).

이 비디오는 면역침전된 용해물의 화학발광 기반 서부 블로팅에 대해 설명합니다. 이 기술은 단백질 처리 및 활성화를 결정하는 데 도움이 됩니다. 감지된 화학발광 신호는 활성화 중 단백질 처리 수준에 비례합니다.

프로토콜

T 세포 실험은 윤리 협약 42502-2-1273 Uni MD에 따라 수행되었습니다.

1. 실험을 위한 세포 준비

참고: 이 면역침전의 평균 세포 수는 1 × 10⁷입니다. 부착 세포는 실험 하루 전에 파종되어 실험 당일에 1 × 10⁷ 세포가 있도록

해야 합니다.

1. 실험을 위한 부착 세포 준비
   1. 실험 시작 하루 전에 각 조건에 대해 20mL의 배지(조성물에 대한 재료 표 참조)에 5-8 ×⁶개의 부착 세포를 14.5cm 접시에 파종합니다.
   2. 실험 당일에는 세포가 80-90% 융합되어 접시에 부착되어 있는지 확인합니다. 배지를 버리고 부착 세포에 새로운 배지를 추가합니다.
2. 실험을 위한 부유 세포 준비
   1. 실험 시작 직전에 14.5cm 접시에 조건에 따라 10mL의 배양 배지(조성물에 대한 재료 표 참조)에 1 ×^{10 7}개의 현탁 세포를 조심스럽게 배치합니다.
   2. 일차 세포를 사용하는 경우, 앞서 설명한 절차에 따라 일차 T 세포를 분리한다. 1μg/mL 피토헤마글루티닌으로 원발T세포를 24시간 동안 치료한 후 25U/mL IL2를 6일 동안 처리합니다.
   3. 실험이 시작되기 직전에 14.5cm 접시에 조건에 따라 10mL의 배양 배지(조성에 대한 재료 표 참조)에 1 ×^{10 8}개의 일차 T 세포를 조심스럽게 놓습니다.
      메모: 이처럼 더 많은 수의 원발성 T 세포는 세포가 더 작기 때문에 권장됩니다.

2. CD95L 자극

1. CD95L(앞에서 설명한 대로 생산되거나 시판되는 제품(재료표 참조))으로 세포를 자극합니다.
   메모: CD95L의 농도와 자극 시간은 세포 유형에 따라 다릅니다. 하나의 자극 조건을 두 번 준비하여 '비드 대조군' 샘플을 병렬로 생성합니다.
   1. 선택된 농도의 CD95L로 부착 세포를 자극합니다. 플레이트를 비스듬히 잡고 부착 세포를 건드리지 않고 리간드를 배지에 피펫으로 넣습니다.
   2. CD95L로 리간드 용액을 세포 현탁액에 피펫팅하여 현탁 세포를 자극합니다.

3. 세포 수확 및 용해

1. 세포 접시를 얼음 위에 놓습니다.
   메모: 매체를 버리지 마십시오. 죽어가는 세포는 배지에 떠다니며 분석에 중요합니다.
2. 세포 현탁액에 10mL의 저온 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가하고 플레이트에서 부착된 세포를 긁어냅니다. 50mL 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다.
3. 10mL의 차가운 PBS로 세포 접시를 두 번 세척하고 세척 용액을 동일한 50mL 튜브에 넣습니다. 세포 현탁액을 500 × g에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리한다.
4. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 차가운 PBS로 재현탁합니다. 세포 현탁액을 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
5. 세포 현탁액을 500 × g에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 차가운 PBS로 재현탁합니다.
6. 세포 현탁액을 500 × g에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.상등액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 용해 완충액(4% 단백질 분해 효소 억제제 칵테일 함유)으로 재현탁합니다. 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
7. 용해물을 최대 속도(~17,000 × g)로 15분, 4°C 동안 원심분리합니다.
8. 상등액(용해물)을 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 버리십시오. 다른 튜브에서 용해물 50μL를 취합니다. Bradford assay로 단백질 농도를 분석하고 바이알에 있는 단백질 25μg에 해당하는 용해물의 양을 취합니다. 바이알에 로딩 버퍼(조성물에 대한 재료 표 참조)를 추가합니다. -20 °C에서 용해물 제어로 보관하십시오.

4. 면역침전(IP)

1. 2 μL의 항-APO-1 항체와 10 μL의 protein A sepharose beads(제조업체에서 권장하는 대로 준비)를 용해물에 추가합니다. 용해물(자극된 샘플)이 들어 있는 별도의 튜브에 비드를 10μL만 추가하여 '비드 대조군'을 생성합니다.
   메모: 팁을 자르거나 단백질 A 세파로스 비드를 취급하는 동안 IP를 위한 특별 팁을 구입하여 구멍이 넓은 피펫 팁을 사용하십시오.
2. 용해액과 항체/단백질 A 세파로스 비드의 혼합물을 4°C에서 밤새 부드럽게 혼합하여 배양합니다. 항체/단백질 A 세파로스 비드로 용해물을 500 × g에서 4분, 4°C 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 비드에 차가운 PBS 1mL를 첨가한 다음 이 단계를 최소 3회 반복합니다.
3. 상등액을 버리십시오. 바람직하게는 50 μL Hamilton 주사기로 비드를 흡입합니다.

5. 웨스턴 블롯

1. 비드에 20μL의 4x 로딩 버퍼(조성은 재료 표 참조)를 추가하고 95°C에서 10분 동안 가열하고 용해물 컨트롤을 95°C에서 5분 동안 가열합니다.
2. 용해물, IP 및 단백질 표준물질을 12.5% SDS(sodium dodecyl sulfate) 겔(겔 준비에 대한 재료 표 참조)에 로드하고 80V의 정전압으로 실행합니다.
3. SDS 젤에서 니트로셀룰로오스 membrane.
   로 단백질을 옮깁니다. 메모: 여기서, 관심 단백질에 최적화된 반건조 기법을 12분(25V, 2.5A= 상수)에 걸친 전달에 사용했습니다. 니트로셀룰로오스 멤브레인과 두 개의 미니 크기 전사 스택을 전기 영동 버퍼(조성물에 대한 재료 표 참조, 제조업체의 지침에 따라 준비)에 웨스턴 블로팅하기 전에 몇 분 동안 담그십시오.
4. 블로트된 멤브레인을 상자에 넣고 블로킹 용액(PBS(PBST)의 0.1% Tween-20 + 우유 5%)에서 1시간 동안 차단합니다. 부드러운 교반 하에서 차단 용액으로 멤브레인을 배양합니다.
5. 멤브레인을 PBST로 5분 동안 세 번 세척합니다.

6. 웨스턴 블롯 감지

1. 표시된 희석액(Table of Materials(재료 표 참조)의 첫 번째 1차 항체를 멤브레인에 추가하고 4°C에서 부드러운 교반으로 밤새 배양합니다.
2. 멤브레인을 PBST로 5분 동안 세 번 세척합니다.
3. 20mL의 2차 항체(PBST에 1:10,000 희석 + 우유 5%)를 넣고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들
어 멤브레인을 배양합니다.
4. 멤브레인을 PBST로 5분 동안 세 번 세척합니다.
5. PBST를 버리고 약 1mL의 양고추냉이 과산화효소 기질을 멤브레인에 추가합니다.
6. 화학발광 신호 감지(재료 표 참조).
   메모: 노출 시간과 캡처된 이미지의 수는 세포 내 단백질의 양과 사용된 항체의 특이도에 따라 달라집니다. 검출에 사용되는 각 항체에 대해 경험적으로 확립되어야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
12.5% SDS 젤	자체 제작		2개의 분리 겔의 경우: 3.28 mL 증류 H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL 아크릴아미드 100 μL 10% SDS 100 μL 10% APS 7.5 μL TEMED 2개의 수집 겔의 경우: 3.1 mL 증류 H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL 아크릴아미드 50 μL 10% SDS 25 μL 10% APS 7.5 μL TEMED
14.5cm 셀 접시	그라이너	639160
아크릴아마이드	칼 로스	답124.1
에어로졸 필터, 높은 회수율 필터와 넓은 오리피스가 있는 피펫 팁	폭스바겐	46620-664(북미) 또는 732-0559(유럽)	비드를 용해물에 피펫팅하는 데 사용됩니다.
비드를 용해물에 피펫팅하는 데 사용됩니다.	시그마 알드리치	A2103	희석 : PBST에서 1:4000 + 1:100 NaN3
안티 APO-1 Ab	P. Krammer 교수가 이러한 실험에서 제공하거나 ENZO에서 구입할 수 있습니다.	ALX-805-038-C100	면역침전에만 사용됩니다.
안티 카스파제-10 Ab	바이오졸	MBL-M059-3	희석: PBST에서 1:1000 + 1:100 NaN3
안티 카스파제-3 Ab	세포 신호 전달	9662 초	희석 : PBST에서 1 : 2000 + 1 : 100 NaN3
항 카스파제-8 Ab C15	P. Krammer 교수가 이러한 실험에서 제공하거나 ENZO에서 구입할 수 있습니다.	ALX-804-242-C100	희석: PBST에서 1:20 + 1:100 NaN3
안티 CD95 Ab	산타 크루즈	사우스캐롤라이나-715	희석 : PBST에서 1 : 2000 + 1 : 100 NaN3
안티-C-FLIP NF6 Ab	P. Krammer 교수가 이러한 실험에서 제공하거나 ENZO에서 구입할 수 있습니다.	ALX-804-961-0100	희석: PBST에서 1:10 + 1:100 NaN3
안티 FADD 1C4 Ab	P. Krammer 교수가 이러한 실험에서 제공하거나 ENZO에서 구입할 수 있습니다.	아디-AAM-212-E	희석: PBST에서 1:10 + 1:100 NaN3
항 PARP Ab	세포 신호 전달	9542	희석: PBST에서 1:1000 + 1:100 NaN3
APS	칼 로스	9592.3
β-메르캅토에탄올	칼 로스	4227.2
Bradford 솔루션 단백질 분석 염료 시약 농축액 450ml	바이오 라드	전화: 500-0006	제조업체의 지침에 따라 사용
CD95L	P. Krammer 교수가 이러한 실험에서 제공하거나 ENZO에서 구입할 수 있습니다.	재질 보기 ALX-522-020-C005
화학발광 검출기 Chem Doc XRS+	바이오 라드
완전 프로테아제 억제제 칵테일(PIC)	시그마 알드리치	재질 보기 ALX-522-020-C005	제조업체의 지침에 따라 준비
DPBS (10x) Ca, Mg 제외	PAN 생명공학	전화04-53500	H2O로 1:10 희석, 냉장고에 보관
전기영동 완충액	자체 제작		10x 전기영동 완충액: 60.6g Tris 288g 글리신 20g SDS ad 2L H2O 1:10 사용 전 희석
글리신	칼 로스	3908.3
염소 안티 마우스 IgG1 HRP	서던바이오텍	1070-05	PBST 1:10.000 희석 + 5% 우유
염소 안티 마우스 IgG2b HRP	서던바이오텍	1090-05	PBST 1:10.000 희석 + 5% 우유
염소 안티 토끼 IgG-HRP	서던바이오텍	4030-05	PBST 1:10.000 희석 + 5% 우유
인터루킨-2 인간 (hIL-2)	머크그룹/로슈	11011456001	T 세포의 활성화를 위해
케이클	칼 로스	6781.2
KH2PO4	칼 로스	3904.1
로딩 버퍼 4x Laemmli 샘플 버퍼, 10mL	바이오 라드	Tel.: 161-0747	제조업체의 지침에 따라 준비
루미나타 포르테 웨스턴 HRP 기판	밀리포어	WBLUFO500
용해 버퍼	자체 제작		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 추가 960 mL H2O
부착성 세포용 배지 DMEM F12 (1:1) w 안정 글루타민, 2,438 g/L	PAN 생명공학	전화04-41154	배지에 10% FCS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.0001% 퓨로마이신 첨가
일차 T 세포용 배지	Life Technologie의 gibco	21875034	배지에 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 추가
분유	칼 로스	T145.4
나2HPO4	칼 로스	P030.3
염화나트륨	칼 로스	3957.2
PBST (영문)	자체 제작		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 Copyright © 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Page 3 of 3 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O 희석 사용 전 1:20
PBST + 우유 5%	자체 제작		분유 50g + PBST 1L
PHA	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	R30852801	T 세포의 활성화를 위해
파워 팩 HC	바이오 라드
프리시전 플러스 프로틴 스탠다드 올 블루	바이오 라드	Tel.: 161-0373	3-5 μL 사이에서 사용
단백질 A 세파로스 CL-4B 비즈	노보디렉트/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	제조업체의 지침에 따라 준비된 친화력 수지 비드
긁는 기구	폭스바겐	Tel.: 734-2602
증권 시세	칼 로스	4360.2
셰이 커	하이돌프
아지드화나트륨	칼 로스	케이305.1
테마드	칼 로스	2367.3
Trans Blot Turbo 미니 사이즈 전사 스택	바이오 라드	170-4270	제조업체의 지침에 따라 사용
TransBlot Turbo 5x 전송 버퍼	바이오 라드	10026938	제조업체의 지침에 따라 준비
TransBlot 터보 미니 사이즈 니트로셀룰로오스 멤브레인	바이오 라드	170-4270	제조업체의 지침에 따라 사용
트랜스 블롯 터보	바이오 라드
트리스	켐 용질	8,08,51,000
트리톤 X-100	칼 로스	3051.4
트윈-20	팬 Reac Appli Chem	대답4974,1000

년 년 년 년 ) 표시기 년 년