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참고: 이 연구에 사용된 재조합 단백질인 Hsp90 및 Cdc37은 상업적으로 얻어졌습니다(재료 표 참조).
1. 칩 활성화
참고: 실험에 사용되는 모든 재료는 재료 표에 나열되어 있습니다. 제균 0.2μm 필터를 통해 준비된 모든 용액을 여과합니다.
- 15mL 튜브에 1M 2-(N-모르폴리노) 에탄 설폰산(MES) 완충액(pH = 6.0) 2.5mL에 EDC 2mg을 첨가하여 1-에틸-3-(3-디메틸아미노 프로필) 카르보디이미드(EDC) 용액을 준비합니다. 별도의 15mL 튜브에 2.5mL의 1M MES 완충액(pH = 6.0)에 6mg의 sulfo-NHS를 첨가하여 N-Hydroxysulfosoxynimide(sulfo-NHS) 용액을 준비합니다.각 용액의 50μL를 독립 튜브에 부분 표본으로 추출하고 나중에 사용할 수 있도록 -20°C에서 보관합니다.
- 위아래로 피펫팅하여 동일한 부피의 EDC와 sulfo-NHS 용액(50 μL of EDC + 50 μL of sulfo-NHS)을 혼합합니다(와류가 발생하지 않음).
참고: EDC/sulfo-NHS의 혼합 용액은 적절한 칩 기능화를 위한 효과적인 가교를 유지하기 위해 30분 이내에 사용해야 합니다.
- 회사에서 제공한 바이오센서 칩(5.7cm x 2.4cm, 재료 표 참조)을 뚜껑이 달린 유리 페트리 접시에 넣습니다. 칩 활성화와 관련된 모든 기능화 단계는 페트리 접시 내에서 수행되는 것이 좋습니다. 50μL의 1M MES 완충액(pH = 6.0)을 바이오센서 칩에 적용하고 실온에서 1분 동안 배양한 다음 완충액을 흡입합니다.
- 50μL의 EDC/sulfo-NHS 용액을 센서 칩에 즉시 적용합니다. 페트리 접시를 덮고 실온에서 15분 동안 배양합니다.칩에서 EDC/sulfo-NHS 용액을 흡입합니다.
- 50μL의 1M MES 버퍼(pH = 6.0)로 칩을 한 번 헹굽니다. MES 버퍼를 흡입합니다.
2. 표적 단백질 고정화
- 칩을 50μL의 1x PBS(pH = 7.4)로 2x 헹굽니다. 칩에서 PBS를 흡인하고 대상 분자 Hsp90 (50 μL; 500 nM).
를 추가합니다.
참고: 버퍼 불일치는 전체 실험을 망칠 수 있습니다. 따라서 실험 전에 표적 분자가 보정에 사용된 것과 동일한 완충액(예: 1x PBS(pH = 7.4))에 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 필요한 경우 실험 전에 야간 투석을 통해 완충액 교환을 수행합니다. 이 실험에서는, 4°C에 적당한 완충액 교환을 가진 1x PBS(PH = 7.4; 물자 표 참조)에 대하여 재조합 단백질, Hsp90 및 Cdc37 둘 다에 대해 밤새 투석을 실행되었습니다. 타겟 물질(이 경우 Hsp90)의 농도는 다양한 실험 프로토콜과 타겟 물질(단백질/펩타이드/리간드)의 특성에 따라 달라질 수 있습니다.
- 유리 페트리 접시를 덮고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 표적 분자가 포함된 용액을 흡입하고 50μL의 1x PBS(pH = 7.4)로 3배 헹굽니다. 칩에서 1x PBS(pH = 7.4) 용액을 흡입합니다.
- 칩에 담금질 1(1x PBS(pH = 7.4)에 3.9mM amino-PEG5-alcohol) 용액 50μL를 추가합니다. 유리 페트리 접시를 덮고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 칩에서 Quench 1 용액을 흡입합니다.
- 칩에 담금질 2(1M 에탄올아민(pH = 8.5)) 용액 50μL를 추가합니다. 유리 페트리 접시를 덮고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 칩에서 퀀치 2 용액을 흡입하고 50μL의 1x PBS를 사용하여 칩을 5번 헹구고 센서의 마지막 PBS 방울을 남겨둡니다.
3. 분석물 샘플 준비
- 원하는 농도 범위에서 Cdc37에 대한 분석물 희석 시리즈를 준비합니다. 첫 번째 실험에서는 25nM, 50nM, 100nM, 200nM, 400nM, 800nM, 1,000nM, 2,000nM, 3,000nM 및 5,000nM의 농도를 사용했습니다. 두 번째 실험에서는 0.4nM에서 200nM 범위의 다른 농도 세트가 사용되었습니다.
- 신뢰할 수 있는 KD 값을 얻기 위해 최소 8개의 서로 다른 분석물 농도를 포함하도록 실험을 설계합니다. 보정 및 표적 단백질에 사용된 것과 동일한 완충액에서 분석물 단백질의 다양한 희석액을 준비합니다. 여기서는 1x PBS(pH = 7.4)입니다.
4. 활성화된 바이오센서 칩을 FEB 장치에 로드
참고: FEB 장치는 LED 조명 표시가 있는 리더와 바이오센서 칩을 삽입하기 위한 카트리지로 구성됩니다.
- 표적 단백질 고정 후 활성화된 칩을 USB를 통해 컴퓨터에 연결된 장치의 카트리지에 삽입합니다. 칩을 삽입한 후 리더에 녹색 LED 표시등이 표시되어 FEB 장치가 실험할 준비가 되었음을 나타냅니다. FEB 장치가 연결된 컴퓨터에 회사에서 제공한 자동화 소프트웨어(재료 표 참조)를 설치하여 아래 설명된 대로 실험을 단계별로 모니터링합니다.
5. 실험 실행
- 자동화된 소프트웨어에서 Run Experiment(실험 실행) 모듈을 누르고 10 Points with Regeneration(재생이 있는 10점) 또는 기타 원하는 프로토콜을 선택합니다. 다음 세부 정보를 입력합니다: 연산자 이름, 실험 이름, 날짜(예: Yana, Hsp90 + Cdc37, 2021년 3월 14일). 재생 버퍼(regeneration buffer) (예를 들어, PBS 버퍼); 고정된 타겟(예: Hsp90); 용액 내 분석물(예: Cdc37).
- 소프트웨어에 표시된 실험 시작 버튼을 누르고 아래 설명된 대로 자동화 소프트웨어에 표시된 지침을 따릅니다.
메모: 이 소프트웨어는 완전히 자동화되고 사용자 친화적이며 실험 전반에 걸쳐 사용자를 단계별로 안내합니다. 실험의 각 단계에서 추가로 진행하기 위한 지침이 포함된 팝업 창이 화면에 나타납니다. 이 소프트웨어는 실험 전반에 걸쳐 각 분석물 농도에 대한 보정, 분석물 결합, 해리, 재생 및 세척(5회)에서 연속적으로 각 반복 단계에 대한 지침을 제공합니다.
- 기기 보정을 수행합니다. 이렇게 하려면 칩에서 나머지 PBS 용액을 흡입하고 50μL의 보정 버퍼(1x PBS, pH = 7.4)를 적용합니다. 계속 버튼을 누르고 보정 단계가 완료될 때까지 5분 동안 기다립니다. 소프트웨어는 교정 단계에 대해 결정된 종점(5분)을 후속 조치를 위한 경고 알람과 함께 표시합니다.
- 다음으로, 분석물 결합을 수행합니다. 이렇게 하려면 칩에서 보정 버퍼를 흡입하고 가장 낮은 분석물 농도의 50μL(Cdc37의 25nM)를 적용합니다. 계속 단추를 누르고 연결 단계가 완료될 때까지 5분 동안 기다립니다. 계속 진행하기 위한 경고 알람과 함께 연결 단계(5분)에 대한 끝점이 표시됩니다.
- 분석물 해리를 수행합니다. 이렇게 하려면 칩에서 분석물 용액을 흡입하고 해리 완충액 50μL(1x PBS, pH = 7.4)를 적용합니다. 계속 단추를 누르고 해리 단계 기간(5분)이 완료될 때까지 5분 동안 기다립니다. 소프트웨어는 후속 조치를 위한 경고 경보와 함께 분리 단계(5분)에 대한 끝점을 표시합니다.
- 다음으로 칩 재생을 수행합니다. 칩에서 해리 용액을 흡입하고 50μL의 재생 완충액(1x PBS, pH = 7.4)을 적용합니다. 계속 버튼을 누르고 재생 단계 기간(30초)이 완료될 때까지 30초 동안 기다립니다. 소프트웨어는 후속 조치를 위한 경고 알람과 함께 재생 단계의 끝점(30초)을 표시합니다.
- 마지막으로 칩을 씻습니다. 칩에서 재생 용액을 흡입하고 칩에 50μL의 세척 버퍼(1x PBS, pH = 7.4)를 적용합니다. 칩에서 용액을 흡입하고 이것을 5번 반복합니다. 칩에 마지막 세척 버퍼 한 방울을 남겨두고 계속 버튼을 누르고 소프트웨어 디스플레이에서 세척 단계 시간이 완료될 때까지 30초 동안 기다립니다.
참고: 소프트웨어는 실험의 다음 주기를 진행하기 위해 경고 알람과 함께 세척 단계(30초)의 끝점을 표시합니다.
- 사용된 각 분석물 농도에 대해 단계를 반복합니다. 보정, 분석물 결합, 해리, 재생 및 세척(5회)의 5단계가 하나의 사이클을 구성합니다. 여기에 표시된 실험을 위해 10개의 분석물 농도(25nM에서 5,000nM 또는 0.4nM에서 200nM에 이르기)에 대해 10사이클을 수행했습니다. 그림 1).
