단일 분자 수준에서 항원-항체 상호 작용을 연구하기 위한 대량 측광

초록

출처: Wu, D. et. al., 질량 측광에 의한 항체-항원 친화도의 신속한 측정. J. Vis. 특급.(2021년)

이 비디오에서는 유동 챔버에서 항원-항체 상호 작용을 연구하기 위해 질량 측광을 사용하는 방법을 보여줍니다. 집중된 빛은 분자의 질량에 따라 다르게 산란됩니다. 검출기는 산란된 빛을 수집하고 간섭 패턴을 분자 질량과 상관관계가 있는 다양한 강도의 스폿으로 생성합니다.

프로토콜

1. 플로우 챔버 준비

1. 유리 커버 슬립 청소
   1. 증류수, 에탄올, 이소프로판올이 든 세척 병을 사용하여 24mm x 50mm 커버슬립을 물, 에탄올, 물, 이소프로판올, 물의 순서로 헹굽니다. 깨끗한 질소 흐름으로 커버슬립을 건조시킵니다. 부드러운 끝의 집게로 하단 모서리를 잡고 커버 슬립을 위에서 아래로 헹구는 것이 중요합니다. 겸자에서 오염물이 옮겨지지 않도록 커버슬립을 같은 방향으로 건조시킵니다(그림 1A).
   2. 마찬가지로 24mm x 24mm 커버슬립을 증류수, 에탄올 및 증류수로 헹굽니다. 깨끗한 질소 흐름으로 커버슬립을 건조시킵니다.
   3. 커버슬립의 작동 면을 확인하고 깨끗한 커버슬립 표면에 증류수 한 방울을 떨어뜨린 다음 프로토콜의 3.1–3.2단계를 따릅니다. 일반적으로 24mm x 50mm 커버슬립의 한쪽 면만 MP 측정에 적합한 광학 품질을 가지고 있습니다.
      메모: 초점을 맞춘 후에는 심각한 표면 결함이 감지되지 않아야 하며 데이터 수집 소프트웨어에 표시된 "신호" 값은 0.05% 미만이어야 합니다(그림 2A-C). 상자에 있는 모든 커버슬립의 작업면은 같은 방향을 향합니다. 커버슬립 청소의 효율성을 테스트하려면 동일한 절차를 사용해야 합니다.
2. 플로우 챔버 조립
   1. 알루미늄 호일 조각에 24mm x 24mm 커버슬립을 놓습니다. 그림 1B와 같이 24mm x 24mm 커버슬립 위에 양면 테이프 스트립을 놓고 유리 가장자리를 따라 테이프를 자릅니다. 알루미늄 호일에서 커버슬립을 분리하여 24mm x 50mm 커버슬립의 작업면에 부착합니다(그림 1C).
      메모: 채널 크기는 다를 수 있지만 3mm–5mm의 너비가 권장됩니다. 채널이 넓을수록 더 많은 샘플 부피가 필요하며 채널이 매우 좁으면 로드하기 어려울 수 있습니다. 일반적으로 24mm x 24mm 커버슬립에서 두 개의 병렬 채널을 쉽게 생성할 수 있습니다. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

2. 친화도 측정을 위해 항체-항원 샘플을 준비합니다

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1. 0.22μm 주사기 필터를 사용하여 최소 2mL의 PBS 버퍼를 필터링하여 먼지 입자 또는 응집체를 제거합니다. 탁상용 원심분리기의 최대 속도(약 16,000 x g)로 10분 동안 단백질 스톡을 원심분리합니다.
   메모: PBS는 이 프로토콜에 권장되는 버퍼이지만 MP에는 특정 버퍼 요구 사항이 없으며 다른 생물학적 버퍼도 허용됩니다. 그러나 높은 글리세롤 농도(>10%)와 매우 낮은 이온 강도(염 농도<10mM)는 이미지 및 데이터 품질에 영향을 미칠 수 있으므로 권장되지 않습니다.
2. 항체 및 항원 스톡의 실제 농도는 280nm UV 흡광도를 측정하여 측정합니다.
3. 항원-항체 혼합물의 측정된 농도를 계산합니다. 항체 결합 친화도의 추정 값을 알 수 없는 경우 30nM 항원 및 20nM 항체 농도로 샘플을 준비할 계획입니다. 대략적인 친화도가 알려진 경우, 항체 대 항원 비율과 농도는 예상되는 K_d 값에 따라 최적화되어야 합니다. 아래 방정식에서 예상되는 K_d와 총 항체 농도의 합과 동일한 혼합물의 총 항원 농도를 사용합니다. 항체의 두 파라톱프에 대해 K_d1 = K_d2를 가정하면 샘플에서 유리 항체와 항체-항원 복합체의 농도가 비슷해집니다.
   
   샘플의 총 단백질 농도를 10nM 및 50nM 범위 내로 유지하도록 항체 농도를 조정합니다. 항체 농도가 5nM에서 25nM.
   사이인 혼합물을 사용하여 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 메모: MP는 분자량이 40kDa보다 큰 단백질을 검출합니다. 결과적으로, 분자량이 40kDa보다 작은 항원의 시료 농도는 일반적인 50nM 한계를 초과할 수 있습니다. 그러나 약 100nM보다 높은 농도에서는 저분자량 항원조차도 K_d 측정의 이미지 품질 및 정확도에 영향을 미칠 수 있습니다.
4. 2.3단계에서 계산된 최종 측정 농도에서 항체-항원 혼합물 50μL를 준비합니다.
   메모: 항원-항체 혼합물의 한 샘플만 K_d 측정에 필요합니다. 그러나 항원 대 항체 비율이 다른 여러 샘플을 준비하면 샘플 농도를 최적화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여러 샘플에서 데이터를 수집하면 글로벌 피팅을 통해 분석할 수 있습니다.
5. 항원-항체 혼합물을 실온에서 약 10분 동안 배양하여 결합 반응이 화학적 평형에 도달할 수 있도록 합니다. 불필요하게 긴 배양 시간을 피하십시오.
   메모: 배양 시간은 결합 역학에 따라 달라질 수 있습니다. 화학적 평형에 도달했는지 확인하기 위해 다른 배양 시간에서 샘플 측정을 반복할 수 있습니다. 시간 불변 K_d 값은 충분히 긴 배양을 나타냅니다. 장기간 배양하면 플라스틱 실험기구 표면에 상당한 단백질 흡착이 발생할 수 있으며, 결과적으로 단백질 농도 측정에 심각한 오류가 발생할 수 있습니다. 이러한 이유로 MP 샘플 준비에는 점착력이 낮은 실험기구가 강력히 권장됩니다.

3. 질량 측광 데이터 수집

1. MP 기기 대물렌즈에 현미경 이멀젼 오일 한 방울을 바르고 조립된 플로우 챔버를 현미경 스테이지에 놓습니다. 오일이 커버슬립과 대물렌즈 사이의 틈에 걸쳐 있는지 확인하십시오.
2. 플로우 챔버를 로드하고 질량 광도계의 초점을 맞춥니다.
   1. 1단계에서 준비한 플로우 챔버 채널의 한쪽 끝에 10μL의 깨끗하고 여과된 완충 용액을 증착합니다. 액체는 모세관 작용에 의해 채널로 들어갑니다.
   2. 스테이지의 Z 위치를 조정하여 24 x 50mm 커버슬립의 작업 표면에 현미경의 초점을 맞춥니다.
      1. 데이터 수집 소프트웨어의 초점 제어 탭에서 거친 스테이지 이동 위 및 아래 버튼을 사용하여 초기 조정을 수행합니다.
      2. Sharpness 버튼을 클릭하여 선명도 신호 판독값을 표시하고 미세 Up 및 Down 조정 버튼을 사용하여 Sharpness 값을 최대화합니다.
      3. 초점 설정 및 초점 잠금 버튼을 클릭하여 초점 추적 기능을 활성화합니다. 적절하게 초점이 맞춰진 이미지(그림 2A, C)의 "신호" 값은 0.05%.
         미만이어야 합니다. 메모: 최대 선명도 위치에서 "신호" 값이 0.05% 이상이면 유리 표면이나 버퍼에 불순물이 있음을 나타낼 수 있습니다.
3. 동일한 채널을 사용하여 20μL의 항체-항원 샘플을 채널의 한쪽에 놓고 다른 쪽 끝의 액체를 작은 블로팅 페이퍼로 블로워하여 로드합니다(그림 1D).
   메모: 3-5mm 너비의 채널 부피는 약 10μL입니다. 추가 샘플 부피는 채널에 존재하는 버퍼를 완전히 교체하고 샘플 희석을 방지하기 위해 권장됩니다.
4. 샘플을 로드한 후 즉시 기록 버튼을 클릭하여 데이터 수집을 시작하고 100초 비디오를 획득합니다(그림 2D).
5. 데이터 수집이 끝나면 파일 이름을 입력하고 확인을 클릭하여 데이터 파일을 저장합니다.
6. 커버슬립을 버리고 이소프로판올을 적신 면 광학 면봉으로 대물 렌즈의 오일을 닦아냅니다.
   메모: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

4. MP 데이터 분석

1. MP 데이터 처리 소프트웨어를 사용하여 수집된 비디오 파일을 처리하여 랜딩 이벤트를 식별합니다.
   1. 파일/열기(File/Open) 메뉴 옵션을 사용하여 해석할 파일을 로드하고 분석(Analyze)을 클릭합니다.
   2. Load 버튼을 클릭하여 보정 기능을 로드하고 File/Save Results As 메뉴 옵션을 사용하여 분석된 데이터를 저장합니다.
2. 분자 질량 분포를 가우스 함수로 피팅하여 샘플에 있는 각 종의 상대 농도를 얻습니다. 이 분석은 일반적인 과학 그래프 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다(재료 표 참조).
   1. "eventsFitted.csv" 파일을 소프트웨어로 가져오고 Plot/Statistics/Histogram 기능을 사용하여 분자 질량 분포(.csv 파일의 M 열)를 플롯합니다.
   2. 히스토그램을 두 번 클릭하여 Plot Properties 창을 엽니다. 자동 구간화를 비활성화하고 2.5kDa의 구간 크기를 선택합니다. Apply 및 Go 버튼을 클릭하여 Bin Centers 및 Counts 데이터를 생성합니다.
   3. Bin Centers 및 Counts 열을 선택하고 Analysis/Peaks 및 Baseline/Multiple Peak Fit 메뉴 기능을 사용하여 히스토그램을 가우스 함수로 맞춥니다. 두 번 클릭하여 분포 플롯의 대략적인 피크 위치를 표시한 다음 Open NLFit 버튼을 클릭합니다.
   4. "xc" 피크 중심에 대한 Fixed 확인란을 선택하고 해당 값을 자유 항체와 단일 및 이중 항원-항체 복합체의 예상 분자량으로 설정합니다. 너비 매개변수에 대한 공유 옵션을 확인합니다. 맞춤 버튼을 클릭합니다. 가우스 성분의 피팅된 피크 높이 값은 표본에 있는 각 종의 상대적 농도를 나타냅니다.
      메모: Bin 크기는 질량 분포 플롯의 해상도를 최적화하기 위해 조정될 수 있습니다. MP 정밀도 한계는 약 1kDa이며, Bin 크기가 작을수록 분포의 잡음이 증폭될 수 있지만 추가 정보는 표시되지 않습니다. 빈 크기가 매우 크면 질량 분포의 세부 사항을 가릴 수 있습니다.
3. 다음 방정식을 사용하여 각 종의 농도 분율을 계산합니다.
   
   여기서 H_i 및 F_i 값은 샘플에서 각각 자유 항체와 단일 및 이중 결합 항체의 피크 높이 및 농도 분율을 나타냅니다.

결과

그림 1: MP 플로우 챔버 준비 및 로딩.(A) 세척 절차를 위한 커버슬립 고정 위치. (B) 알루미늄 호일(하단 층, 표시되지 않음) 표면에 24 x 24mm 커버슬립(중간 층)과 양면 테이프(상단 층)의 정렬. 파란색 파선은 절단선의 위치를 나타냅니다. (C) 두 개의 샘플 채널이 있는 조립된 플로우 챔버의 상단 및 측면 모습, 그리고 조립된 플로우 챔버의 사진. (D) 이전에 버퍼로 채워진 유동 채널로의 샘플 로딩 절차.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
어쩌다	레펜		MP 데이터 수집 소프트웨어
반인륜 트롬빈	혈액 기술	AHT-5020	RRID: AB_2864302
코튼 팁 애플리케이터	쏘랩스	CTA10	렌즈 청소를 위한 면 광학 면봉
커버슬립 24x24mm	글로브 사이언티픽	1405-10
커버슬립 24x50mm	피셔 사이언티픽	12-544-EP
디스커버MP	레펜		MP 데이터 처리 소프트웨어
집게	전자 현미경 과학	78080-CF	커버슬립 취급을 위한 부드러운 팁 겸
인간 α-트롬빈	혈액 기술	HCT-0020
이멀젼 오일	쏘랩스	모일-30
이소프로파놀	알파 에자르	36644
마이크로소프트 엑셀	마이크로소프트		스프레드시트
원MP	레펜		질량 측광 기기
기원	오리진랩		과학적인 그래프 작성 소프트웨어
PBS (PBS)	코 닝	46-013-CM	10x 주식
주사기 필터	밀리포어	SLGSR33SS	버퍼 및 샘플 필터링

시리즈 년 시리즈 자