살아있는 박테리아의 단백질-단백질 상호 작용 특성화를 위한 FLIM-FRET 이미징

초록

출처: Manko, H. et al., FLIM-FRET 살아있는 박테리아에서 단백질-단백질 상호 작용의 측정. J. Vis. 특급 (2020)

이 비디오는 형광 단백질, 공여자 eGFP 및 수용체 mCherry로 표지된 세포질 단백질을 발현하는 살아있는 박테리아에서 단백질-단백질 상호 작용을 결정하기 위한 FLIM-FRET 이미징 기술에 대해 설명합니다. 결합된 기술은 또한 상호 작용하는 단백질의 정량화를 허용합니다.

프로토콜

1. 아가로스 패드의 준비 (그림 1)

1. 평평한 수평면에 현미경 유리 슬라이드를 놓습니다. 초기 슬라이드의 각 측면에 두 겹의 접착 테이프로 덮인 두 개의 유리 슬라이드를 배열합니다.
   메모: 용융된 아가로스가 접착 테이프로 슬라이드에 퍼지는 것을 방지하기 위해 정렬된 세 개의 슬라이드 사이에 1-2mm의 공간을 유지하십시오.
2. 피펫을 삐삐삐질러 유리 슬라이드에 70μL의 1% 용융된 아가로스 한 방울을 붓습니다. 상단에 네 번째 슬라이드를 추가하여 아가로스 방울을 평평하게 하고 부드럽게 누릅니다. 1분 정도 기다립니다.
3. 상단 슬라이드를 제거하고 피펫으로 약 3μL의 박테리아를 아가로스 패드의 다른 위치에 있는 3-4개의 지점에 떨어뜨립니다.
4. 현미경 유리 커버 슬립 (예 : 22x22mm # 1.5 두께)으로 덮으십시오 .
   메모: 커버슬립의 평탄도와 두께는 이광자 여기(two-photon excitation)를 사용하는 데 중요합니다. 제어된 균일한 평탄도와 낮은 자가형광을 가진 정밀 커버슬립은 일반적으로 좋은 선택입니다.
5. 녹은 파라핀으로 커버슬립을 고정하여 커버슬립을 유리 슬라이드에 밀봉합니다. 커버슬립의 네 모서리를 고정하는 것으로 시작하십시오.

2. 이광자 현미경 설정을 사용한 이미징

참고: 당사는 디스캔된 형광 수집 모드에서 작동하는 60x 1.2NA 수침 대물렌즈와 함께 집에서 만든 이광자 여기 스캐닝 도립 현미경을 사용하고 있습니다. 이광자 여기 파장은 930nm로 설정됩니다. 10-20mW에서 작동하는 Ti:Sapphire 레이저(80MHz 반복률, ≈ 70fs 펄스 폭)에 의해 제공됩니다. 형광 광자는 680nm 단역 통과 필터와 525/50nm 대역 통과 필터를 통해 수집되어 시간 상관 단일 광자 계수(TCSPC) 모듈에 연결된 광섬유 결합 애벌랜치 포토다이오드로 전달되었습니다. 현미경에는 투과 형광 램프도 장착되어 있습니다. 현재 여러 FLIM-FRET 현미경이 상용화되어 있으며 많은 이미징 시설에는 FLIM-FRET 측정을 수행할 수 있는 설정이 장착되어 있습니다.

1. 형광 램프를 사용하여 샘플의 박테리아 단층에 대물렌즈를 집중시키고 관심 영역을 선택합니다.
2. 여기 레이저 셔터가 닫혀 있고 레이저에서 나오는 적외선이 차단되어 현미경에 들어가지 않는지 확인하십시오.
   주의: 레이저 광은 눈으로 볼 수 없기 때문에 IR 펄스 레이저로 작업할 때는 세심한 주의와 지속적인 경계가 있어야 하지만, 일시적인 직접 노출 또는 레이저 반사는 매우 해로울 수 있으며 돌이킬 수 없는 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 현미경 검사 설정을 사용하기 전에 현지 레이저 안전 절차 및 교육을 참조하십시오.
3. 현미경 슬라이드를 s에 놓습니다.tage 커버 슬립이 대물렌즈를 향하도록 합니다.
4. 형광 램프가 켜져 있는지 확인하십시오.
5. 필터 큐브 터렛을 돌려 eGFP 큐브를 선택하고 형광 램프 셔터를 엽니다.
6. 형광을 현미경의 접안렌즈 쪽으로 보냅니다.
   주의: 눈을 손상시킬 수 있는 형광 램프에서 나오는 직접 여기광을 버리기 위해 광 경로에 적절한 필터가 배치되어 있는지 확인하십시오.
7. 현미경 손잡이를 사용하여 대물렌즈를 박테리아에 초점을 맞춥니다.
8. 전동식 스테이지를 제어하는 조이스틱을 사용하여 샘플에서 관심 영역을 변환하여 선택합니다
   메모: 고형광 샘플을 사용하면 초점을 맞추기가 더 쉬워 형광을 눈으로 직접 볼 수 있습니다.
9. FLIM-FRET 측정을 위해 2PE 레이저의 여기를 전환합니다.
10. 형광 방출 경로를 검출기 쪽으로 다시 보냅니다.
11. 필터 큐브 터렛을 뒤로 돌려 930nm 레이저에 대한 이색성 큐브를 선택합니다.
12. 레이저 출력을 20mW로 설정합니다.
13. 관심 영역의 크기를 30μm로 설정합니다. 이 작업은 galvo-mirrors를 작동하는 전압을 조정하고 이동 범위를 정의합니다 (그림 2).
14. 검출기를 켜고 샘플 스캔을 시작합니다 - 스캔을 제어하는 시작 및 중지 버튼은 안전상의 이유와 샘플의 광표백을 제한하기 위해 레이저 셔터의 개폐를 제어합니다(그림 2).
15. 필요한 경우 현미경 미세 초점 손잡이를 약간 움직여 초점을 조정합니다.
16. 컴퓨터 인터페이스에서 스테이지를 미세하게 이동하여 이미징을 위한 시야를 선택합니다. 이는 이미지의 새로운 중심을 정의할 현미경 제어 소프트웨어(그림 2)에서 이미지의 십자가를 이동하고 "Move Stage"를 눌러 설정에서 수행할 수 있습니다. 획득을 위한 좋은 시야는 10-30개의 움직이지 않는 박테리아가 모두 올바르게 초점을 맞춘 이미지에 해당합니다(모든 박테리아가 동일한 평면에 있음). 단일 세포 FLIM-FRET 데이터를 추출하는 데 관심이 있는 경우 박테리아가 잘 개별화되어 있는지 확인하십시오(이미지 분할이 훨씬 쉬울 것입니다).

결과

그림 1. 아가로스 패드 준비.

그림 2. microscope control software의 인터페이스에 대한 개략적인 표현

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
525/50nm 대역 통과 필터	F37-516, AHF, 독일
680nm 단역 통과 필터	F37-516, AHF, 독일
아가로스	시그마-알드리치	A9539
Fiber-coupled avalanche 포토다이오드	SPCM-AQR-14- FC, 퍼킨 엘머
유리 커버 슬립 (두께 번호 1.5, 20×20mm	니텔 유리	MS0011
현미경 슬라이드(25×75mm)	니텔 유리	MS0057 (영문
TCSPC 모듈	SPC830, Becker & Hickl, 독일
Ti : 사파이어 레이저	Insight DeepSee, 스펙트럼 물리학

(영문) )