Cell Adhesion Molecules 간의 Trans Interaction을 검출하기 위한 Cell Aggregation Assay

초록

출처: Restrepo, S., et al., 이종 세포 시스템에서 단백질 응집을 통한 세포 간 상호 작용 측정. J. Vis. 특급 (2020)

이 비디오에서는 HEK 세포 응집 분석을 통해 시냅스 세포 접착 분자 간의 세포 간 상호 작용을 측정하는 기술을 보여줍니다. 이 분석에서는 원하는 시냅스전 세포 접착 분자와 형광 단백질을 발현하는 동일한 수의 HEK 세포를 시냅스후 세포 접착 분자 및 다른 형광 단백질을 발현하는 HEK 세포와 혼합합니다. 세포 접착 분자 간의 상호 작용은 세포를 응집시키며, 이는 형광 현미경으로 측정할 수 있습니다.

프로토콜

1. 세포 배양 및 transfection

1. DMEM, 4.5g/L 포도당, L-글루타민 및 피루브산나트륨 및 10% FBS가 보충된 1x(Dulbecco's Modification of Eagle's Medium)로 HEK 세포 배지를 만듭니다. 멸균 필터.
2. 응집 분석에 적합한 리간드 및 수용체를 사전 결정합니다.
   메모: Neurexin3α SS4+/- 및 알려진 리간드 중 하나인 LRRTM2가 이 연구에 사용되었습니다. 관심의 리간드 및 수용체는 pcDNA3.1의 cDNA로부터 발현되었다. Gibson 어셈블리를 사용하여 Neurexin3α를 pcDNA3.1에 삽입했습니다. Neurexin3α F/R:
   TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.
3. HEK293T 세포를 준비합니다.
   1. HEK293T 세포가 하나의 T-75 플라스크에서 포화되도록 성장시킵니다.
   2. 융합되면 트립신 2mL를 사용하고 37°C 인큐베이터에 2분 동안 넣습니다. 플라스크에 HEK 배지 6mL를 추가하여 세포를 재현탁시키고 8mL를 모두 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
   3. 500 x g에서 5분 동안 펠렛화하고 HEK 세포 배지에 총 8mL 동안 재현탁합니다.
   4. 세포를 계수하고 735,000개의 세포를 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. HEK 세포 배지를 사용하여 각 웰에 대해 최종 부피를 2mL로 조정합니다.
   5. 37 °C 인큐베이터에 넣고 세포가 하룻밤 동안 또는 50-60% 포화도에 도달할 때까지 자랄 때까지 기다립니다.
4. 인산칼슘 방법을 사용하여 HEK293T 세포를 transfection합니다.
   1. well-1을 3 μg의 관심 단백질로 transfection하고 1 μg의 형광 단백질(3 μg의 pcDNA3.1-Neurexin3α^WT, SS4- 및 1 μg의 mCherry)과 함께 transfection합니다.
   2. 1.4.1단계에서와 같이 well-2를 transfection하되, 관심있는 돌연변이된 단백질(pcDNA3.1-Neurexin3α^A687T, SS4-)을 사용합니다.
   3. well-3을 관심 리간드 3 μg으로 transfection하고 다른 형광 단백질 1 μg(pcDNA3.1 LRRTM2 3 μg 및 GFP 1 μg)과 함께 transfection합니다.
   4. well-4 및 well-5를 negative control로 transfection: well-4는 1μg의 GFP로, well-5는 1μg의 mCherry로 수행합니다.
   5. 추가 조건 또는 제어가 필요한 경우 다른 플레이트(1.4.1-1.4.4 단계와 같이)를 준비합니다(Neurexin3α^WT/A687T, SS4+).
      메모: transfection 효율은 epifluorescence microscope에서 transfection 후 24시간 후에 분석되고 transfection된 형광 단백질을 발현하는 세포의 수로 정량화됩니다. 보다 간소화된 접근법에는 형광 단백질과 관심 리간드를 코딩하는 bicistronic 벡터를 사용한 HEK 세포의 transfection이 포함되며, 이는 co-transfection보다 강력히 권장됩니다. 이 연구의 경우, 알파 뉴렉신은 ~4.3kb이며 낮은 형광 강도는 co-transfection이 필요한 bicistronic 시스템을 사용하여 관찰되었습니다.
5. transfection 후 48시간 후, 응집을 위해 세포를 수확합니다.
   1. PBS로 각 우물을 두 번 씻으십시오.
   2. PBS의 10mM EDTA 1mL를 각 웰에 추가하여 세포 간 상호 작용을 부드럽게 해리하고 플레이트를 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
      메모: 트립신은 연구에서 접착 분자의 잠재적인 단백질 분해 절단으로 인해 1.5.b 단계에 권장되지 않습니다. 또한 EDTA 추가 후 세포가 이제 주변 조건에 노출되므로 프로토콜이 완료될 때까지 중지되지 않을 수 있습니다.
   3. 플레이트를 부드럽게 두드려 세포를 분리하고 각 웰을 별도의 15mL 원뿔형 튜브로 채취합니다.
   4. 원심분리기 원뿔형 튜브를 500 x g에서 5분 동안 실온에서 사용합니다.
6. 세포가 펠릿화되는 동안 각 마이크로 원심분리기 튜브의 상단에 각 조건을 표시하여 6개의 배양 튜브를 준비합니다.
   메모: GFP 및 mCherry 조건의 각 순열은 모든 실험 조건과 적절한 대조군을 포괄하기 위해 사용해야 합니다. 예: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3α^WT SS4-—m체리, 4. GFP/Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3α^WT SS4---mCherry/LRRTM2-GFP, 6. Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. 추가 조건 및 제어 장치를 수용하기 위해 추가 튜브를 만드십시오.
7. 상층액을 제거하고 37°C로 예열된 10mM CaCl₂ 및 10mM MgCl₂를 사용하여 500μL의 HEK 배지에서 세포를 재현탁합니다.
   메모: CaCl₂ 및 MgCl₂를 추가하면 접착 분자가 결합을 다시 설정할 수 있으며 해당 세포 간 상호 작용 파트너가 접착을 위해 2가 양이온을 필요로 하는 경우에만 필요합니다.
8. 혈구계를 사용하여 각 15mL 코니컬 튜브의 세포를 계수하고 각 조건의 세포 200,000개를 1.6단계에서 적절한 튜브로 분취하여 총 부피 500μL.
   에서 1:1 혼합합니다. 메모: 조건당 수량을 계산하고 분취하는 데 5분밖에 걸리지 않습니다.
9. 느린 튜브 회전기에서 실온에서 튜브를 배양합니다.

2. 이미지 획득

1. 특정 샘플에 대한 현미경 획득 매개변수를 최적화합니다. 이 예에서는 광시야 현미경으로 이미지를 촬영했습니다. 5x 공중 대물렌즈를 사용하십시오(개구수: 0.15; WD: 20000 μm)를 사용하여 분석을 위한 충분한 필드를 얻을 수 있습니다.
2. 1.8단계에서 HEK 셀의 두 조건을 혼합한 직후 기준선 응집을 평가합니다. 이것들은 이제 '타임 제로' 이미지입니다.
   1. 각 샘플 혼합물 40 μL를 하전 된 현미경 슬라이드에 피펫팅하고 488 및 561 채널 모두에서 형광 이미지를 추출합니다.
   2. 샘플 드롭당 하나의 초점 평면에서 3개의 서로 다른 시야를 획득합니다.
3. 60분에 최종 이미지를 'time 60' 이미지로 획득합니다.
   1. 60분 배양 후 혼합물의 'time 60' 이미지를 얻으려면 회전 튜브에서 각 조건의 다른 40μL 샘플을 취하고 각 샘플을 충전된 슬라이드에 피펫팅합니다. 2.2.
      단계와 같은 이미지 메모: 포화가 발생할 때까지 15분마다 세포 응집을 확인해야 합니다. 응집 시기는 테스트 중인 단백질에 따라 다릅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
스냅 캡이 있는 5mL 일회용 마이크로튜브	폭스바겐	89000-028	HEK 세포의 혼합 집단 배양
1000 mL Rapid—플로우 필터 장치, 0.2 um aPES 멤브레인	써모 피셔	567-0020	HEK 매체의 살균
15 mL SpectraTube 원심분리기 튜브	워드의 과학	제470224-998	HEK 세포 채취
6웰 멸균 조직 배양 플레이트	폭스바겐	제100062-892	HEK 세포 배양
염화칼슘	시그마	223506-500지	인산칼슘 형질주입, HEK 세포 재현탁
원심분리기 - Sorvall Legend RT	Kendro 실험실 제품	75004377	HEK 세포 채취
CO2 세포 배양기	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	헤라셀 150i	성장 중 HEK 세포의 배양
DMEM, 1x (Dulbecco의 Eagle's Medium의 변형) 4.5 g/L 포도당, L-글루타민 & 피루브산 나트륨	코 닝	10-013-이력서	HEK 셀 유지 보수
Dulbecco의 인산염 완충 식염수 PBS (1X)	지브코	14190-144	HEK 세포 가계화/수확
에틸렌디아민테트라아세트산	시그마	ED-500G	HEK 세포 채취
Falcon 통풍 배양 플라스크, 75cm2 성장 면적	코 닝	9381엠26	HEK 세포 배양
소 태아 세럼	시그마	17L184	HEK 셀 유지 보수
HEK293T 세포	증권 시세		모델 시스템
이미지J	국립보건원(NIH)	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	이미지 분석
염화마그네슘 육수화물	시그마	M9272-500G	HEK 세포 재현탁
인산나트륨 이염기성 무수	Fisher BioReagents	BP332-500	인산칼슘 형질주입(Calcium phosphate transfection)
트립신 0.25%(1X) 용액	GE 헬스케어 생명과학	SH30042.01	HEK 세포 계대 분석
튜브 로테이터			HEK 세포의 혼합 집단 배양
UltraClear 현미경 슬라이드. 백색 서리로 덥은, 양수 위탁되는	덴빌 사이언티픽 Inc.	M1021	이미지 획득
광시야 현미경	자이스	악시오 베르트 200M	이미지 획득

호 호 ) 포함 년 표시기