In Situ 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 근접 결찰 분석(Proximity Ligation Assay)

초록

출처: Wang, X., et al., 근접 결찰 분석을 사용한 예쁜꼬마선충 생식세포에서 리보핵단백질 복합체 조립의 현장 검출.J. Vis. 특급(2020년)

이 동영상은 선충 세포에서 현장 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다. 관심 단백질의 근접성은 2차 항체에 부착된 PLA 프로브의 도움으로 원형 DNA 템플릿을 생성합니다. 프로브는 긴 단일 가닥 DNA를 생성한 후 검출기 프로브의 혼성화를 생성하는 증폭 용액을 사용하여 추가로 증폭되어 세포 내 단백질-단백질 상호 작용의 국소화를 가능하게 합니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜은 잠재적인 상호 작용 파트너가 모두 태그되는 C. elegans 균주를 사용합니다. 하나의 표지된 단백질이 다른 표지된 후보 상호작용 파트너와 상호 작용할 것으로 예상되지 않는 음성 대조군 균주를 사용하는 것이 강력히 권장됩니다. 여기서 DLC-1은 웜에서 GFP와 상호 작용할 것으로 예상되지 않기 때문에 GFP만 사용하여 배경을 평가했습니다. GFP 태그가 지정된 OMA-1이 실험 균주로 사용되었으며, 예비 데이터는 DLC-1과의 상호 작용을 시사합니다. 3xFLAG 태그가 지정된 DLC-1과 함께 제어 및 테스트 단백질을 공동 발현하는 선충 균주는 이 텍스트에서 3xFLAG::D LC-1이라고 합니다. GFP 및 3xFLAG::D LC-1; OMA-1::GFP(요청 시 균주 제공, 자세한 내용은 재료 표 참조). 여기서는 3xFLAG 및 GFP 태그가 사용됩니다. 그러나, 다른 태그는 이들의 항체가 PLA 키트 시약과 호환되는 한 대체될 수 있다.

1. 동물 관리

1. OP50 E. coli의 균주가 파종된 선충 성장 배지(NGM) 플레이트에 기생충을 유지하고 GFP의 최적 발현을 위해 24°C를 유지합니다.
2. 성충을 2-3일마다 통과시켜 벌레를 번식시키고 잘 먹게 합니다.

2. 동기 배양 준비

1. 잘 먹인 육즙이 많은 자웅동체 접시를 표백하여 벌레를 동기화하십시오. 표백 프로토콜은 Porta-de-la-Riva et al.에 설명되어 있습니다. 배아를 24°C의 원심분리 튜브에서 하룻밤 동안 부화시키면서 10mL의 M9 최소 배지(M9) 완충액에서 끝에서 끝으로 회전시킵니다. 이것은 포획된 L1 유충의 문화를 생산할 것입니다.
2. 포획된 L1 단계 유충의 튜브를 얼음 위에서 10분 동안 배양한 다음 얼음처럼 차가운 1x M9로 튜브를 채웁니다.
3. 원심분리기를 사용하여 600 x g의 유충을 4°C에서 5분 동안 펠릿화합니다.상등액이 1-2mL만 남도록 상등액을 조심스럽게 흡입합니다.
4. 유충 펠릿을 재현탁하고 마이크로피펫을 사용하여 2μL의 부유 유충 배양물을 유리 슬라이드로 옮깁니다. 유충 배양의 밀도를 결정하기 위해 얼마나 많은 유충이 있는지 세면 2.5.
   단계에서 벌레의 파종을 안내하는 데 도움이 됩니다. 메모: 10-15 L1 유충/1 μL의 밀도가 파종에 적합합니다.
5. 마이크로피펫을 사용하여 60mm OP50 플레이트에 약 100-120개의 L1 단계 유충을 파종하는 데 필요한 유충 배양의 양을 옮깁니다. 예를 들어, 밀도가 10 L1 유충/1μL 배양액의 유충 배양액 10μL를 파종합니다.
   메모: 유충의 씨를 뿌리기 위해 40μL의 부피를 초과하지 마십시오. 그렇지 않으면 과도한 액체가 OP50 잔디를 방해할 수 있습니다. 배양 부피가 40μL를 초과하면 2.3-2.4단계를 반복하여 부피를 더 줄이고 유충 배양의 밀도를 높입니다.
6. 24 °C에서 벌레를 성장시킵니다.L1이 플레이트에 파종되는 시간을 기록하고 주기적으로 발달 단계를 확인하여 이상적인 해부 시간을 식별합니다.
   메모: L1 파종 후 52시간이 지나면 24°C에서 배양된 지렁이는 일반적으로 생식선 표적 PLA를 박리하기에 이상적인 단계인 젊은 성인 단계에 있습니다. 그러나 동기화된 벌레가 성체 단계에 도달하는 실제 시간은 균주와 배양 온도에 따라 다를 수 있습니다.

3. 해부/생식선 압출

참고: 생식선 대상 PLA가 성공적으로 작동하려면 생식선을 돌출시키기 위한 해부가 필요합니다. 이 접근 방식은 PLA에 대해 이 프로토콜을 사용하여 작동하는 배아를 방출할 수도 있습니다(자세한 내용은 토론 참조). 해부 후, 음성 대조군과 실험 샘플을 모두 고정하고 PLA를 병렬로 함께 처리합니다. 또한 관심 단백질 파트너의 발현 패턴을 입증하기 위해 형광 동시 면역염색을 목적으로 추가 샘플 세트를 준비할 것을 제안합니다.

1. 30-40마리의 어린 성충을 500μL의 1x M9 + 레바미솔(2.5mM 최종 농도)이 들어 있는 시계 유리 접시에 넣습니다. 벌레를 수집한 후 대부분의 매체를 조심스럽게 제거하고 폐기하여 벌레와 함께 옮겨지는 박테리아를 제거합니다.
2. 신선한 500μL의 1x M9 + 레바미솔을 추가하고 피펫을 사용하여 매체를 부드럽게 끌어올리고 분주하여 벌레를 헹굽니다. 벌레와 함께 옮겨지는 박테리아를 제거하기 위해 대부분의 매체를 조심스럽게 제거하고 버리십시오.
   1. 모든 박테리아가 제거될 때까지 이 단계를 2x-3x 반복합니다. 세척이 완료된 후 수분을 유지하기 위해 약 100μL의 배지에 기생충을 남겨 둡니다.
      메모: 벌레를 미디어에 7분 이상 방치하면 해부 중 생식선 압출이 손상되므로 미디어에 두지 마십시오. 해부 현미경의 도움으로 세척을 수행하여 매체 제거를 모니터링하여 벌레가 손실되지 않도록 합니다.
3. 유리 또는 폴리에틸렌 피펫을 사용하여 0.001% 폴리-L-라이신으로 코팅된 25mm x 75mm 현미경 슬라이드로 웜을 옮깁니다(이 절차에 사용된 슬라이드에는 에폭시 코팅된 둘레가 있어 각각 14mm x 14mm의 3개의 작업 공간이 남습니다). 약 10-15 μL의 배지가 남도록 여분의 매체를 제거합니다.
4. 해부 현미경의 도움과 두 개의 261/2 게이지 바늘을 사용하여 한 바늘 끝을 다른 바늘 위에 올려 놓고 끝이 한 쌍의 가위를 형성하도록 합니다. 이런 식으로 방향을 잡은 바늘을 사용하여 인두 뒤의 벌레를 잘라 생식세포를 풀어준다. 5분 이내에 모든 벌레를 해부하십시오.
   메모: 해부를 수행하는 방법에 대한 자세한 내용은 Gervaise와 Arur의 이전 간행물에서 찾을 수 있습니다.
5. 모든 벌레를 해부한 후 슬라이드에 수직이 되도록 슬라이드 위에 22mm x 40mm 커버슬립을 부드럽게 놓습니다. 커버슬립의 끝은 슬라이드에 매달려 있어야 합니다.
6. 드라이아이스에 보관된 미리 냉각된 알루미늄 블록에 슬라이드를 최소 20분 동안 얼립니다. 얼음 팽창으로 인해 커버슬립이 헐거워지는 것을 방지하기 위해 커버슬립 위에 식힌 연필을 부드럽게 올려놓습니다.

4. 고정/차단

1. 고정할 준비가 되면 연필이나 기타 뭉툭한 도구로 커버슬립을 튕겨내고 즉시 슬라이드를 신선하고 얼음처럼 차가운 메탄올(-20°C로 냉각)이 들어 있는 병에 1분 동안 담그십시오.
2. 샘플을 둘러싸고 있는 슬라이드의 가장자리를 부드럽게 닦아 다음 시약이 샘플 주변의 표면 장력에 의해 유지되도록 합니다. RT.
   에서 5분 동안 150μL의 고정제(100mM KH₂PO_4, pH = 7.2의 2% 포름알데히드)를 적용합니다. 메모: 우리는 또한 메탄올/아세톤 고정 절차를 테스트했으며 PLA 반응과 호환되는 것을 발견했습니다.
3. 슬라이드를 종이 타월에 수직 90° 각도로 터치하여 고정제가 슬라이드에서 흘러나와 종이 타월에 흡수되도록 합니다. 50mL의 PBS/1% Triton X-100/1% 소 혈청 알부민(PBT/BSA)이 들어 있는 Coplin 용기에서 RT에서 15분 동안 2x 블록 슬라이드를
   메모: 코플린 항아리 또는 다른 유형의 염색 항아리는 이 차단 단계와 아래 섹션 6-9의 세척 단계에 권장됩니다. 이는 샘플과 함께 차단 또는 세척 버퍼를 효율적으로 교환할 수 있는 충분한 부피를 제공합니다.
4. 10%의 일반 염소 혈청을 함유한 PBT/BSA 용액으로 슬라이드를 차단합니다. 슬라이드를 둘러싼 가장자리를 부드럽게 닦고 용액 100μL를 슬라이드에 적용합니다. 습한 챔버에서 RT에서 1 시간 동안 배양하십시오 .
   메모: 이 단계는 αFLAG 1차 항체로 염색하는 데 적극 권장됩니다. 습한 챔버는 슬라이드가 배양할 때 눕힐 수 있도록 트레이에 테이프로 유리 피펫을 고정하여 구성됩니다. 댐핑된 작업용 와이프(Table of Materials)를 트레이에 배치하여 트레이의 내부 습도를 높여 증발을 방지합니다. 뚜껑과 트레이는 빛에 민감한 단계에서 빛으로부터 샘플을 보호하기 위해 호일로 덮여 있습니다.
5. PBT/BSA/10%NGS 용액이 슬라이드에서 흘러내리도록 슬라이드를 종이 타월에 놓고 슬라이드의 가장자리를 부드럽게 닦습니다. 차단 시약(Table of Materials)을 사용하여 슬라이드를 차단합니다. 14mm x 14mm 공간에 한 방울을 떨어뜨립니다. 습한 챔버에서 37 °C에서 1 시간 동안 슬라이드를 배양합니다.

5. 1차 항체 배양

참고: 최상의 PLA 결과와 최소한의 배경 지식을 얻으려면 1차 항체의 희석 계수를 최적화해야 할 수 있습니다(자세한 내용은 설명 참조). 또한, 1차 항체는 PLA에 사용되는 2차 항체의 특이성과 일치하는 다른 숙주에서 발생해야 합니다.

1. 종이 타월 위에 슬라이드를 올려 차단 시약이 슬라이드에서 흘러내리도록 하고 가장자리를 부드럽게 닦습니다. 항체 희석제(Table of Materials)를 사용하여 1차 항체를 희석합니다. 14mm x 14mm 공간당 40μL의 1차 항체 용액을 적용합니다.
2. 4 °C의 습한 챔버에서 밤새 슬라이드를 배양합니다.

6. PLA 프로브(2차 항체) 배양

참고: 6-9단계에서는 RT에서 세척 버퍼 A와 B를 사용합니다. 완충액을 4 °C에서 보관하는 경우 사용하기 전에 RT로 데우십시오.

1. Coplin 용기에 담아 RT에서 50mL의 1x 세척 버퍼 A(Table of Materials)를 사용하여 슬라이드를 5분 동안 2회 세척합니다. 60rpm으로 설정된 궤도 셰이커에 Coplin jar를 설정합니다.
2. 종이 타월 위에 슬라이드를 올려 세탁 버퍼가 슬라이드에서 흘러내리도록 하고 가장자리를 부드럽게 닦습니다. PLUS 및 MINUS 프로브(항체 희석제로 1:5 희석)를 포함하는 40μL 용액을 준비합니다. 각 14mm x 14mm 공간에 솔루션을 적용합니다.
3. 37°C에서 1시간 동안 습한 챔버에서 슬라이드를 배양합니다.

7. 결찰

1. Coplin 용기에 담긴 RT에서 50mL의 1x 세척 버퍼 A로 슬라이드를 5분 동안 2회 세척합니다. 60rpm으로 설정된 궤도 셰이커에 Coplin jar를 설정합니다.
2. 결찰 완충액(Table of Materials)을 초순수로 1:5로 희석합니다. 이 완충액을 사용하여 리가제(Table of Materials)를 1:40으로 희석하여 결찰 용액의 작업 재고를 준비합니다.
   1. 슬라이드를 종이 타월에 올려 세탁 버퍼가 슬라이드에서 흘러내리도록 하고 가장자리를 부드럽게 닦습니다. 각 14mm x 14mm 공간에 40μL의 결찰 용액을 도포합니다.
3. 습한 챔버에서 37°C에서 30분 동안 슬라이드를 배양합니다.

8. 증폭

참고: 적색 형광단이 포함된 검출 시약(Table of Materials)을 사용하면 예쁜꼬마선충 조직에서 background 를 최소화할 수 있습니다.

1. Coplin 용기에 담긴 RT에서 50mL의 1x 세척 버퍼 A로 슬라이드를 5분 동안 2회 세척합니다. 60rpm으로 설정된 궤도 셰이커에 Coplin jar를 설정합니다.
2. 증폭 적색 완충액(Table of Materials)을 초순수로 1:5로 희석합니다. 이 완충액을 사용하여 중합효소(재료 표)를 1:80으로 희석하여 증폭 용액의 작업 재고를 준비하고 빛으로부터 보호합니다.
   1. 슬라이드를 종이 타월에 올려 세탁 버퍼가 슬라이드에서 흘러내리도록 하고 가장자리를 부드럽게 닦습니다. 각 14mm x 14mm 공간에 40μL의 증폭 용액을 도포합니다.
3. 37°C에서 1시간 및 40분 동안 습한 챔버에서 슬라이드를 배양합니다. 습기가 많은 챔버가 빛으로부터 샘플을 보호하기 위해 호일로 덮여 있는지 확인하십시오.

9. 최종 세척

1. Coplin 용기에 담아 RT에서 50mL의 1x 세척 버퍼 B(Table of Materials)를 사용하여 슬라이드를 10분 동안 2회 세척합니다. 60rpm으로 설정된 궤도 셰이커에 Coplin jar를 설정합니다.
2. Coplin 용기에 담아 RT에서 50mL의 0.01x 세척 버퍼 B로 슬라이드를 1분 동안 세척합니다. 60rpm으로 설정된 궤도 셰이커에 Coplin jar를 설정합니다. 이 버퍼는 세척 버퍼 B를 초순수로 희석하여 준비됩니다.

10. 커버슬립 장착

1. 여분의 세탁 버퍼를 슬라이드에서 종이 타월로 흘려보내고 슬라이드의 에폭시 코팅 둘레에 남아 있는 버퍼를 닦아냅니다.
2. 샘플에 10μL의 장착 매체(Table of Materials)를 추가하고 그 위에 커버슬립을 부드럽게 놓아 장착 매체가 펼쳐지도록 합니다.
3. 커버슬립 가장자리 주위를 매니큐어로 칠하여 커버슬립을 밀봉하고 미끄러집니다. 생식세포를 손상시킬 수 있는 커버슬립이 움직이지 않도록 매니큐어를 부드럽게 바르십시오. 매니큐어를 RT에서 최소 20분 동안 굳히고 슬라이드를 빛으로부터 보호하는 동안 현미경으로 보기 전에 확인하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
16% 파라포름알데히드 용액	전자 현미경 서비스	15710	4% 작동 용액을 만드는 데 사용됩니다
1M 케이피2PO4	시그마	P0662	1M 작업 재고 준비
M9 1개	다양한	다양한	1x에서 사용되는 10x 스톡으로 준비됨; 프로토콜은 wormbook.org 참조
PBS 1개	다양한	다양한	프로토콜에 대한 wormbook.org 참조하십시오.
26.5 게이지 바늘	엑셀 인터내셔널	26402	해부에 사용되는 바늘
증권 시세	램파이어	7500802
원심분리기 튜브	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	05-529씨	동기화에 사용되는 50ml 오크 릿지 원심 분리기 튜브
컨포칼 현미경	자이스	880
코플린 항아리	폴리랩	62101
샘플을 동결하기 위한 커버슬립	글로브 사이언티픽	1411-10	22x40mm, 1번
Coverslip to Seal Slide	글로브 사이언티픽	1404-15	22x22mm, 1.5호
면역형광을 위한 DAPI 장착 배지	벡터	H-1200
리가아제	시그마-알드리치	DUO82029	Duolink 1x Ligase, Duolink In Situ Detection Reagents Red 키트의 일부로 제공DUO92008
증폭 빨간색 버퍼	시그마-알드리치	DUO82011	Duolink 5x 증폭 레드 버퍼, Duolink 현장 검출 시약 레드 키트의 일부로 제공DUO92008
결찰 완충액	시그마-알드리치	DUO82009	Duolink 5x 결찰 버퍼, Duolink 현장 검출 시약 레드 키트의 일부로 제공DUO92008
항체 희석제	시그마-알드리치	DUO82008	Duolink 항체 희석제, DUO92004 및 DUO92002 함께 제공, 참고: 1x PBS/1% BSA 용액을 항체를 희석하기 위한 대용품으로 사용할 수도 있습니다.
차단 솔루션	시그마-알드리치	DUO82007	Duolink 차단 솔루션, DUO92004 및 DUO92002 함께 제공
PLA용 장착 매체	시그마-알드리치	DUO82040	Duolink In Situ 마운팅 미디어(DAPI 포함)
마이너스 프로브	시그마-알드리치	DUO92004	Duolink 현장 프로브 안티 마우스 MINUS
PLUS 프로브	시그마-알드리치	DUO92002	Duolink In Situ 프로브 안티 래빗 PLUS
세척 버퍼 A	시그마-알드리치	DUO82046	Duolink In Situ 워시 버퍼 A
세척 버퍼 B	시그마-알드리치	DUO82048	Duolink In Situ 세척 버퍼 B
폴리메라이제	시그마-알드리치	DUO82030	Duolink 중합효소, Duolink 현장 검출 시약 레드 키트의 일부로 제공DUO92008
Epifluorescent Microscope (에피 형광 현미경	라이카		DFC300G 카메라, DM5500B 현미경
염소 안티 마우스 Alexa 594	잭슨이뮤노	전화: 115-585-146	1:500에 사용
염소 안티 토끼 Alexa 488	잭슨이뮤노	Tel.: 111-545-144	1:200에 사용
유리 피펫	코 닝	7095B-5배
레바미솔	아크로스 오가닉스	187870100	250mM 작업 재고 준비
메탄올	피셔 사이언티픽	대답454
마우스 안티 FLAG	시그마	F1804	면역형광 및 PLA를 위해 1:1000에서 사용, 일반 염소 세럼으로 사전 차단 권장
네일폴리쉬	L.A. 색상	CNP195
선충 성장 배지(NGM)	다양한		프로토콜에 대한 wormbook.org 참조하십시오.
노멀 염소 세럼	잭슨이뮤노	TEL.005-000-121
폴리에틸렌 파스퇴르 피펫	글로브 사이언티픽	135030
폴리-L-라이신	시그마-알드리치	P1524	물에 0.1% 원액으로 제조하여 -20°C에서 보관하고 물에 1:100으로 희석하여 슬라이드를 코팅합니다
페트리 접시	(주)트라이텍	PD7060	직경 60mm
토끼 안티 GFP	써모 피셔	G10362	면역형광의 경우 1:200, PLA의 경우 1:4000에서 사용
슬라이드	써모 피셔	30-2066A-브라운	바가 있는 3각 14x14mm 오토클레이브 슬라이드는 Fisher Scientific을 통해 맞춤 주문됩니다. 실험실의 슬라이드에 Poly-L-Lysine을 첨가했습니다.
차아염소산나트륨 용액	피셔 사이언티픽	SS290-1 (영어
작업 지우기	(주)킴텍	34120	4.4x8.4 인치 작업용 물티슈
트레이 (242x241x20mm)	써모 피셔	240845	습한 챔버를 만드는 데 사용
트리톤 X-100	아크로스 오가닉스	327372500
초순수	밀리큐		Milli-Q 일체형 정수 시스템에서 얻은 초순수
감시유리	캐롤라이나 생물학	742300
-20 °C 냉동고
-80 °C 냉동고
알루미늄 호일
OP50 균주 대장균
오비탈 셰이커
테이프
이 연구에 사용된 선충 균주(요청 시 둘 다 제공)
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]		UMT 376 (영어	dlc-1 무도회::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR;오마-1 무도회::오마-1::GFP; 참조 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III		UMT 422 (영어	dlc-1 무도회::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 무도회::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); 참고: 이 연구

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