1. 면역침전
참고: 다음 섹션에 설명된 대로 비나트륨 도데실 설페이트(SDS) 용해 완충액과 구연산염 용출액을 사용했습니다. 그러나 대체 사내 면역침전 기법을 사용하는 것도 LC-MS/MS 시료 준비에 적용할 수 있습니다.
- epitope tag 단독 또는 융합 단백질을 인코딩하는 벡터로 배양된 세포를 transfection합니다. 대표 데이터를 획득하기 위해 양이온성 리포좀을 사용하여 녹색 형광 단백질(GFP) 단독 또는 GFP 융합 Capn6(calpain-6 유전자)을 인코딩하는 벡터로 J774 세포(1 x 106)를 전달합니다.
- 자성 비드에 접합 항체.
- 이를 위해 1.5mL 시험관에서 500μL의 시트레이트 인산염 완충액(24.5mM 구연산, 51.7mM 이염기성 인산나트륨, pH 5.0)에 항-GFP 항체(2μL/반응)와 자성 비드(25μL/반응)를 혼합합니다.
- 혼합물을 실온에서 50시간 동안 1rpm으로 회전합니다. 그런 다음 0.1% 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트를 함유한 시트레이트 인산염 완충액으로 IgG 접합 비드를 3회 세척합니다.
- 적절한 용해 완충액을 사용하여 transfection된 세포를 용해합니다. 대표적인 데이터를 획득하기 위해 형질주입된 세포를 400μL의 용해 완충액(50mM Tris-HCl, pH 7.5, 120mM NaCl, 0.5% 폴리(옥시에텔레렌) 옥틸페닐 에테르)에서 30분 동안 용해합니다. 및 형질주입 24시간 후 1.5mL 시험관에 1mM 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA)을 넣습니다.
- 15,000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 용해액을 세척하고 상층액을 수집합니다.
- 용해물을 미리 정리합니다. 1.5mL 시험관에 표지되지 않은 마그네틱 비드(25 μL/반응)를 추가합니다. 500μL의 시트레이트 인산염 완충액으로 비드를 세 번 세척합니다. 최종 세척에서 시트레이트 인산염 완충액을 제거한 후 마그네틱 비드 위에 세포 용해물을 추가합니다. 실온에서 30분 동안 50rpm의 회전자를 사용하여 혼합물을 회전시킵니다.
- 자기 분리를 위해 시험관을 자기 스탠드에 5분 동안 놓고 세포 용해물을 수집합니다. 제조사에서 지정한 마그네틱 스탠드를 사용하는 것이 좋습니다.
- 타겟 단백질을 conjugated beads에 결합합니다. 면역글로불린(Ig)G-conjugated beads를 자기 분리를 위해 마그네틱 스탠드에 5분 동안 놓고 citrate buffer를 버린 다음 cell lysate를 분리된 beads에 추가합니다.
- 혼합물을 실온에서 50시간 동안 1rpm으로 회전합니다.
- 표적 단백질을 유리 비표적 단백질에서 분리합니다. 0.1% 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트가 함유된 500μL의 시트레이트 인산염 완충액을 사용하여 비드를 세 번 세척합니다. 최종 세척 후 30μL의 시트레이트 완충액(pH 2–3)을 추가하고 실온에서 5분 동안 배양하여 표적 단백질을 용리합니다.
메모: 면역침전으로부터의 회복이 불충분한 경우, FLAG 또는 HIS와 같은 대체 항원결정기 태그를 사용하면 효율을 향상시킬 수 있습니다. 용리액의 효율이 충분하지 않은 경우 SDS 기반 용액과 같은 다른 용리액을 사용하면 효율이 향상될 수 있습니다.
2. 단백질의 멤브레인 분해
참고: 외인성 단백질로 인한 오염을 방지하기 위해 단백질이 없는 재료와 장비를 사용하는 것이 필요합니다. 또한 작업자는 인간 단백질에 의한 오염을 방지하기 위해 수술용 마스크와 장갑을 착용하는 것이 좋습니다.
- 수술용 가위를 사용하여 PVDF 멤브레인을 3mm x 3mm 조각으로 자른 후 메탄올로 닦고 사용 직전에 건조시킵니다.
- 깨끗한 알루미늄 호일의 PVDF 멤브레인 조각에 2–5μL의 에탄올을 추가합니다.
- 완전히 건조되기 전에 친수성 PVDF 멤브레인에 용리액(각 2–5μL, 샘플당 4–6개)을 추가한 다음 멤브레인 표면이 무광택이 될 때까지 멤브레인을 자연 건조합니다. 건조된 멤브레인은 4°C에서 보관할 수 있습니다.
- 모든 멤브레인을 1.5mL 플라스틱 튜브로 옮기고 20–30μL의 에탄올을 첨가하여 멤브레인을 친수성으로 만든 다음 피펫을 사용하여 에탄올을 제거합니다.
- 멤브레인이 완전히 건조되기 전에 200μL의 디티오트레이톨(DTT) 기반 반응 용액(80mMNH4HCO3, 10mM DTT 및 20% 아세토니트릴)을 넣고 56°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 반응 용액을 300μL의 요오드아세트아미드 용액(80mMNH4HCO3, 55mM 요오드아세트아미드 및 20% 아세토니트릴)으로 교체하고 어두운 곳에서 실온에서 45분 동안 배양합니다.
- 1mL의 증류수로 멤브레인을 두 번 세척하고 1mL의 2% 아세토니트릴로 한 번 >10초 동안 소용돌이 혼합하여 멤브레인을 세척합니다.
- 동결건조된 MS 등급 트립신(Table of Materials)을 반응 용액(70% 아세토니트릴을 함유한 30mM NH4HCO3)에 직접 용해시킵니다. 1μg의 트립신(재료 표)(70% 아세토니트릴을 함유한 30mM NH4HCO3)을 함유한 반응 용액 100μL를 첨가하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 트립틱 분해물이 포함된 반응 용액을 피펫을 사용하여 깨끗한 1.5mL 시험관에 옮깁니다.
- 멤브레인에 세척 용액 100μL(70% 아세토니트릴/1% 트리플루오로아세트산)를 추가하고 60°C에서 2시간 동안 배양합니다. 세척 용액을 수집하여 반응 용액과 혼합합니다. 멤브레인에 100μL의 세척 용액을 더 추가하고 10분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 세척 용액을 수집하여 반응 용액과 혼합합니다.
- 시험관을 실험실 필름 조각으로 덮고 바늘로 두 개의 작은 구멍을 만듭니다. 진공 농축기를 사용하여 용액을 건조시킵니다.
- 잔류물을 0.2% 포름산 10μL에 용해시킵니다. 원심분리(12,000 × g, 실온에서 3분) 후 상등액을 샘플 튜브로 옮깁니다.
메모: 세척은 이 섹션의 중요한 단계입니다. 멤브레인 단백질을 분해하는 동안, 동결된 단백질을 포함하는 멤브레인을 환원 후 증류수로 알킬화한 후 2% 아세토니트릴을 각각 10초 이상 세척하는 것은 시약 제거에 매우 중요합니다.
