리간드와 분석물 간의 상호 작용을 감지하기 위한 Biolayer Interferometry 기술

초록

출처: Desai, M., et al. 전사에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 BLI(Biolayer Interferometry)의 적용. J. Vis. 특급 (2019년)

이 동영상에서는 리간드와 표적 분석물 간의 분자간 상호 작용을 실시간으로 검출하는 BLI(Biolayer Interferometry) 기술을 시연합니다. BLI는 용액 내 분석물과 상호 작용할 때 바이오센서 표면의 고정된 리간드 층에서 반사된 백색광의 간섭 패턴 변화를 측정합니다.

프로토콜

1. 바이오센서 수화 및 분석 설정

1. BLItz 기기를 켭니다.
2. 기기가 기기 뒷면의 USB 데이터 출력 포트를 통해 컴퓨터에 연결되어 있는지 확인하십시오.
3. 컴퓨터에서 관련 소프트웨어(예: BLItz Pro)를 열고 화면 왼쪽에 있는 Advanced Kinetics를 클릭합니다.
4. 소프트웨어에서 각 제목 아래에 실험에 대한 모든 적절한 정보(실험 이름, 설명, 샘플 ID 및 단백질 농도 포함)를 입력합니다.
5. Biosensor Type(바이오센서 유형)을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 Ni-NTA를 선택합니다.
   1. 실행 설정 제목에서 셰이커가 사용으로 설정되어 있는지 확인합니다.
   2. 단계 유형 목록 제목 아래에 초기 기준선, 로드, 기준선, 연결 및 분리의 5개 항목이 나열되어 있는지 확인합니다.
      메모: 각 단계의 기간은 필요에 따라 기본값에서 변경할 수 있습니다. 최적의 결과를 얻으려면 Initial Baseline 및 Baseline에 최소 30초를 사용하십시오. 그리고 120 s는 연합 및 해리에 대한 것입니다. 로딩 단계(120초에서 240초 범위)의 지속 시간은 리간드의 농도 및 리간드에 있는 His-에피토프 태그와 Ni-NTA-바이오센서의 친화력에 따라 달라집니다.
6. PCR 튜브에서 수화된 Ni-NTA 바이오센서를 제거하고 바이오센서의 넓은 부분을 마운트에 밀어 기계의 바이오센서 마운트에 부착합니다.
   메모: 실험 중에 바이오센서가 건조되지 않도록 하십시오.
7. 0.5mL 검은색 마이크로 원심분리기 튜브를 기계의 튜브 홀더에 넣고 BLI 버퍼의 400μL를 피펫팅합니다.
8. 튜브 홀더가 기계의 검은색 화살표 앞에 위치하도록 기계의 슬라이더가 위치에 있는지 확인합니다.
9. 바이오센서 팁이 마이크로 원심분리기 튜브의 버퍼에 잠기도록 기계의 덮개를 닫습니다.
10. 소프트웨어에서 Next(다음)를 클릭하여 Initial Baseline 기록을 시작합니다.

2. 바이오센서에 리간드 로딩

1. 초기 기준선 단계가 기록을 완료한 후 기기의 덮개를 엽니다.
2. 드롭 홀더(튜브 홀더 대신)가 검은색 화살표 앞에 오도록 슬라이더를 오른쪽으로 이동합니다.
3. 투석된 His 태그가 부착된 리간드 4μL를 드롭 홀더에 피펫팅하고 기계의 덮개를 닫습니다.
   참고: 사용할 리간드의 최적 농도는 단백질마다 다를 수 있습니다. 1.0에서 2.0 mg/mL 사이의 농도는 일반적으로 240초 내에 바이오센서 끝의 NTA를 포화시키기에 적합합니다.
4. 소프트웨어에서 다음을 클릭하여 로드를 시작합니다.

3. 추가 리간드 세척

1. 로딩 단계가 녹음을 완료한 후 기기의 덮개를 엽니다.
2. 튜브 홀더가 다시 한 번 검은색 화살표 앞에 위치하도록 슬라이더를 왼쪽으로 이동합니다.
3. 기계의 뚜껑을 닫고 바이오센서 팁이 튜브 홀더에 있는 튜브의 BLI 버퍼에 잠겨 있는지 확인합니다.
4. 소프트웨어에서 다음을 다시 한 번 클릭하여 기준선 기록을 시작합니다.

4. 분석물과 리간드의 연관

성

1. 기준선 단계가 녹음을 완료한 후 기기의 덮개를 엽니다.
2. 드롭 홀더를 제거하고 단백질을 피펫으로 빼내고 이중 탈이온수(ddH₂O)로 총 5회 헹궈 청소합니다.
   1. 세탁 후 티슈 물티슈를 사용하여 드롭 홀더 표면을 청소하십시오.
3. 드롭 홀더를 기계에 다시 장착합니다.
4. 드롭 홀더가 다시 한 번 검은색 화살표 앞에 위치하도록 기기의 슬라이더를 오른쪽으로 이동합니다.
5. 투석된 분석물 4μL를 드롭 홀더에 피펫팅하고 기계 커버를 닫습니다.
6. 소프트웨어에서 Next(다음)를 클릭하여 Association(연결)을 시작합니다.

5. 리간드에서 분석물의 해리

1. 연결 단계가 녹음을 완료한 후 기기의 덮개를 엽니다.
2. 튜브 홀더가 다시 한 번 검은색 화살표 앞에 위치하도록 기계의 슬라이더를 오른쪽으로 이동합니다.
3. 소프트웨어에서 다음을 클릭하여 분리를 시작합니다.
4. Dissociation 단계에서 녹음이 완료되면 기기의 덮개를 엽니다.
5. 드롭 홀더와 튜브 홀더를 제거합니다.
6. 단백질을 씻어내기 위해 둘 다 ddH₂O로 철저히 헹굽니다.
7. 바이오센서를 제거하고 안전하게 폐기하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BLItz 기계	포르테바이오	45-5000	장치
Ni-NTA 바이오센서 트레이 담그기 및 읽기	포르테바이오	제18-5101	poly-His-tagged 단백질을 위한 즉시 사용 가능한 Ni-NTA 바이오센서
드롭 홀더	포르테바이오	제45-5004	장치
PCR 튜브(0.2mL)	토마스 사이언티픽	CLS6571	플라스틱 도자기
마이크로 원심분리기 튜브(검정색)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	전화 03-391-166	플라스틱 도자기
킴와이프	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	06-666ᅡ	플라스틱 도자기
디티(DTT)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	R0861	화학
에디타	밀리포어시그마	E6758	화학
재질 보기 MgCl2	밀리포어시그마	M8266	화학
염화나트륨	밀리포어시그마	S9888	화학
트리스 - HCl	골드바이오	T095100	완충기