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1. 시료 전처리: 세포-세포 혼합 분석
참고: 다음 프로토콜은 부착 세포에 대한 혼합 절차를 설명합니다. 현탁액에서 배양된 세포에 대해 변형될 수 있습니다.
- transfection 하루 전에 6-well 플레이트에 적절한 수의 세포를 seed합니다(예: 800,000 HEK 293T 세포(Neubauer 계수 챔버로 계수). 이 수는 seeding과 transfection 사이의 시간에 따라 수정할 수 있으며 다른 세포 유형에 맞게 조정할 수 있습니다. 기본 실험(즉, 관심 단백질과 음성 대조군)을 수행하려면 최소 4개의 웰을 준비합니다. Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium) 배지에서 37°C, 5% CO2에서 세포를 배양하고 소 태아 혈청(10%) 및 L-글루타민(1%)을 보충합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 세포를 transfection합니다(Table of Materials(재료표) 참조).
- 기본 실험을 수행하기 위해 '녹색'(예: 단량체 강화 녹색 형광 단백질(mEGFP) 또는 황색 형광 단백질(mEYFP)) 또는 '빨간색'(예: mCherry 또는 mCardinal) 형광 단백질에 융합된 관심 단백질에 대한 플라스미드를 별도의 웰에서 transfection합니다.
메모: 이 프로토콜에서는 APLP1-mEYFP 및 APLP1-mCardinal과 해당 음성 대조군(예: myristoylated-palmitoylated-mEYFP(myr-palm-mEYFP) 및 -mCardinal(myr-palm-mCardinal))에 중점을 둡니다. 일반적으로 200 ng - 1 μg의 플라스미드 DNA로 충분합니다. transfection 효율이 높으면 접촉하는 '빨간색' 및 '녹색' 세포를 찾을 수 있는 기회가 높아집니다. transfection 효율을 최적화하기 위해 plasmid 및 transfection 시약의 양을 수정합니다. 비판적인: 세포를 transfection할 때 세포 밀도는 약 70%가 되어야 합니다. 세포가 과도하게 결합되면 transfection 효율이 감소합니다. 세포가 충분히 융합되지 않으면 형질주입 및 혼합이 스트레스를 유발하고 혼합 후 많은 세포가 적절하게 부착되지 못하게 할 수 있습니다.
- transfection 후 ~4± 2시간 후에 세포 혼합을 수행합니다.
- 성장 배지를 제거하고 Mg2+ 및 Ca2+가 보충된 1mL PBS로 각각 부드럽게 씻습니다. 그런 다음 PBS를 제거합니다. (위험) 세척 중 세포가 분리되는 것을 방지하기 위해 웰 가장자리에 PBS를 떨어뜨립니다.
- ~50μL 트립신 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액을 각 웰에 적음으로 첨가하여 세포의 분리를 용이하게 합니다. 37°C에서 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 6웰 플레이트를 측면으로 천천히 흔들어 세포를 분리합니다.
메모: 일부 세포 유형의 경우 배양 시간 연장이 필요할 수 있습니다.
- 각 웰에 950μL의 성장 배지를 추가하고 위아래로 몇 차례 피펫팅하여 세포를 재현탁시켜 웰 바닥에서 모든 세포를 분리합니다. (위험) 세포가 적절하게 재현탁되고 서로 분리되도록 재현탁 후 큰 세포 응집체가 없는지 육안으로 확인합니다. 그렇지 않으면 혼합 후 많은 '빨간색'-'빨간색' 또는 '녹색'-'녹색' 접점을 얻을 수 있습니다.
- 하나의 웰(관심있는 단백질 또는 음성 대조군)의 세포 용액을 해당 웰, 즉 '빨간색'(예: APLP1-mCardinal 형질주입)을 '녹색'(예: APLP1-mEYFP 형질주입) 세포로 전달합니다. 위아래로 몇 번 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 혼합 세포를 35mm 유리 바닥 접시(접시당 혼합 세포 용액 1mL, 성장 배지 1mL)에 파종하고 37°C, 5% CO2에서 하루 더 배양합니다.
2. 시료 준비: 교차 상관 실험을 위한 포지티브 컨트롤 및 밝기 분석을 위한 호모-이량체 구조
- 세포 계수실로 계수된 600,000개의 HEK 293T 세포를 transfection 하루 전에 35mm 유리 바닥 접시에 파종합니다. 37°C, 5% CO2 에서 완전한 DMEM 배지(단계 1.1 참조)에서 하루 더 세포를 배양합니다.
- 제조업체 지침에 따라 ~250ng의 플라스미드 DNA로 세포를 transfection합니다. 양의 교차 상관 제어를 위해 관심 단백질의 FP에 해당하는 myr-palm-mCherry-mEGFP 또는 myr-palm-mCardinal-mEYFP 같은 멤브레인 앵커 형광 단백질 이종이량체를 인코딩하는 플라스미드를 사용합니다. 밝기 보정을 위해 관심 단백질에 융합된 FP에 해당하는 멤브레인 앵커 FP 단량체와 호모 이량체(예: myr-palm-mEYFP 및 myr-palm-mEYFP-mEYFP)를 모두 인코딩하는 플라스미드를 사용하여 APLP1-mEYFP의 밝기 분석을 보정합니다.
- 37°C에서 5% CO2를 완전한 DMEM 배지(단계 1.1 참조)에서 하루 더 배양합니다.
3. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경: 설정 및 초점 부피 보정
참고: 다음 프로토콜은 이 연구에 사용된 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에서 mEGFP/mEYFP 및 mCherry/mCardinal로 수행된 실험을 위해 작성되었습니다. 광학 설정, 소프트웨어 설정(레이저 라인, 다이크로익 미러, 필터) 및 보정 염료 선택은 다른 FP 및 현미경 설정에 맞게 수정될 수 있습니다.
- 레이저 안정성과 온도 평형을 보장하기 위해 실험 최소 한 시간 전에 현미경과 레이저를 켜십시오.
- 100-200 μL의 적절한 수용성 형광 염료 용액(예시는 재료 표 참조)을 물 또는 PBS에 준비하여 10-50 nM 범위의 농도로 초점 부피를 보정합니다.
- 염료 용액을 깨끗한 35mm 유리 바닥 접시 #1.5, 즉 두께가 0.16-0.19mm.
인 접시에 놓습니다.
메모: 이상적으로는 두께 허용 오차가 낮은 고성능 커버 유리(예: 0.170 ± 0.005mm)가 있는 접시를 사용하여 최적의 칼라 링 보정을 가능하게 합니다(3.6단계). 나중에 다음 실험에 사용되는 것과 동일한 유형의 요리를 사용하는 것이 중요합니다.
- 염료 용액이 들어있는 접시를 대물렌즈에 직접 놓고(바람직하게는 NA 1.2를 사용하여 물에 담그십시오) 용액에 초점을 맞출 수 있도록 합니다. 또는 접시를 샘플 홀더에 놓고 샘플에 초점을 맞춥니다(예: 접시 바닥에서 10-20μm 위).
알림: 수성 샘플에 깊숙이 초점을 맞출 때 얻어지는 신호가 좋지 않기 때문에 오일 대물렌즈를 사용하지 않는 것이 좋습니다.
- 여기 및 방출 경로를 설정합니다(예: 488nm 레이저, 488/561nm 이색성 미러, 감지 창 499-552nm 및 1 Airy 단위(AU)의 핀홀 크기 선택). 핀홀 크기가 교차 상관 측정에 사용될 크기와 동일한지 확인하십시오.
- 핀홀 위치(핀홀 조정)와 대물렌즈 칼라 링을 조정하여 카운트 속도를 최대화합니다. 이를 위해 최대 카운트 속도가 감지될 때까지 칼라 링을 돌립니다.
메모: 칼라 링 보정은 사용된 커버 유리의 특정 두께를 고려합니다. 계수 속도를 최대화하는 것, 즉 분자당 가능한 한 많은 광자를 수집하는 것은 측정의 신호 대 잡음비(SNR)를 최대화하는 데 중요합니다.
- 교차 상관 측정에 사용되는 것과 동일한 레이저 출력(일반적으로 ~1%, 즉 ~1-2μW)에서 일련의 포인트 FCS 측정(예: 서로 다른 위치에서 6개의 측정, 각각 10초씩 15회 반복, 즉 총 2.5분 체류 시간 이하로 샘플링)을 수행합니다.
- 삼중항 기여(수식 1)를 포함하는 3차원 확산 모델을 data.
에 피팅합니다.
메모: 일반적으로 얻어진 확산 시간은 약 30μs이고 구조 계수는 약 4-8입니다.
- 방정식 2.
에 따라 실온에서 사용된 염료의 확산 계수에 대해 측정된 평균 확산 시간과 발표된 값에서 waist w0를 계산합니다.
일반적인 값은 200-250nm입니다.
- 필요한 경우 두 번째 검출 채널(예: 561nm 여기 및 570nm과 695nm 사이의 검출)에 대해 다른 형광 염료를 사용하여 보정 루틴(단계 3.4-3.9)을 반복합니다. 핀홀 위치와 크기를 첫 번째 감지 채널에 대해 설정된 대로 유지합니다.
- 보정 측정값에서 분자 밝기(수식 3)를 계산하고 얻은 값을 저장합니다.
메모: 사용된 설정의 일반적인 값은 1.8μW 488nm 여기 전력에 대해 ~8-10kHz/분자(MOL)입니다. 평소보다 낮은 값은 대물렌즈에 먼지가 있거나 설정이 잘못 정렬되었거나 레이저 출력이 감소했음을 나타낼 수 있습니다. 파워 미터를 사용하여 정기적으로 목표에서 레이저 출력 전력을 확인하고 보관하십시오. 다양한 설정을 비교하기 위해 여기 레이저 출력에 의해 정규화된 분자 밝기는 현미경 성능을 평가하는 데 가장 의미 있는 매개변수입니다.
4. 주사 형광 교차 상관 분광법: 획득
참고: 다음 프로토콜은 이 연구에 사용된 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에서 mEGFP/mEYFP('녹색') 및 mCherry/mCardinal('빨간색')로 수행된 실험을 위해 작성되었습니다. 광학 설정 및 소프트웨어 설정(레이저 라인, 다이크로익 미러, 필터)은 다른 FP 또는 현미경 설정에 따라 다를 수 있습니다.
- 광학 경로(예: 488 nm 및 561 nm 여기와 488/561 nm 이색성 미러, 488 nm 여기의 경우 1 AU의 핀홀)를 설정합니다. 스펙트럼 누화를 방지하려면 두 개의 개별 트랙을 선택하여 mEGFP/mEYFP(488nm 여기, 녹색 채널) 및 mCherry/mCardinal(561nm 여기, 빨간색 채널)을 순차적으로 여기하고 감지한 다음 모든 라인에서 스위치 트랙을 선택합니다. 감지를 위해 두 채널 모두에 적절한 필터를 사용하십시오(예: 녹색 채널의 경우 499-552nm, 빨간색 채널의 경우 570-695nm).
- 교대 여기가 불가능한 경우 빨간색 채널에 적절한 필터 설정을 사용하여 스펙트럼 누화를 최소화합니다(즉, 600nm 미만이 아닌 mCherry/mCardinal 형광 감지). 이는 적색 채널에서 검출되는 광자의 양을 감소시킬 수 있으며, 따라서 SNR을 감소시킬 수 있다.
- 혼합된 세포가 들어있는 접시를 s에 놓습니다.amp르 홀더. 온도 평형을 보장하고 초점 드리프트를 줄이기 위해 최소 10분 동안 기다립니다.
- Locate 메뉴의 투과광을 사용하여 세포에 초점을 맞춥니다.
- 서로 접촉하는 한 쌍의 '빨간색' 세포와 '녹색' 세포를 검색합니다. 양의 교차 상관 또는 호모 이합체 밝기 제어(섹션 2 참조)를 위해 두 채널 모두에서 형광을 방출하는 분리된 세포 또는 PM.
참고: (중요) 세포를 검색하는 동안 샘플 노출을 최소화하여 교차 상관을 감소시킬 수 있는 사전 표백을 피하십시오. 따라서 가장 빠른 스캔 속도와 낮은 레이저 출력으로 스캔하십시오. 강하게 발현하는 세포를 이미징하는 동안 검출기 포화를 피하려면 통합 모드에서 검색하십시오. 그러나 노출을 최소화하기 위해 광자 계수 모드에서 더 낮은 레이저 출력으로 스캔할 수 있습니다.
- 그림 1B 및 2A와 같이 Crop 버튼을 사용하여 셀-셀 접촉(또는 양의 교차 상관 또는 호모-이합체 밝기 제어를 위한 단일 셀의 PM)에 수직인 스캔 경로를 선택합니다.
메모: 일부 구형 현미경은 임의의 스캔 방향을 허용하지 않습니다. 이 경우, 스캔 방향에 수직인 방향을 가진 셀-셀 접촉부를 배치해야 합니다.
- 50-200nm의 픽셀 크기를 얻기 위해 확대/축소하고 스캔 모드에서 선을 선택합니다. 프레임 크기를 128 × 1픽셀로 설정합니다.
메모: 일반적인 픽셀 크기는 160nm이며, 이는 약 20μm의 스캔 길이에 해당합니다.
- 스캔 속도를 최대 허용 값(예: 라인당 472.73μs)으로 설정합니다.
메모: 대체 여기 방식의 경우 이는 954.45μs 스캔 시간, 즉 사용된 설정에서 ~1000 스캔/초에 해당합니다. 스캔 속도는 관심 단백질의 확산 계수에 따라 조정될 수 있습니다. 멤브레인 고정 단백질의 경우 일반적인 확산 시간은 약 10-20ms입니다. 스캔 시간은 확산 시간보다 최소 10배 작아야 합니다. 스캔 속도가 낮을수록 더 강한 광표백이 유발되고 더 낮은 조명력이 필요할 수 있습니다. 또는 Time Series 하위 메뉴의 Interval을 사용하여 매우 천천히 확산되는 복합체에 대해 각 스캔 사이에 일시 중지(예: 5ms)를 부과할 수 있습니다.
- 적절한 레이저 출력(예: 488nm의 경우 ~1-2μW, 561nm 여기의 경우 ~5-10μW)을 선택합니다.
메모: 레이저 출력이 높을수록 SNR이 향상되지만 광표백이 증가합니다. 따라서 광표백이 초기 계수율의 50% 미만이 되도록 레이저 출력을 선택해야 합니다.
- 주기를 100,000-500,000.
로 설정합니다.
메모: 스캔 횟수, 즉 측정 시간은 다를 수 있습니다: 측정 시간이 길수록 SNR이 향상되고 분자가 천천히 확산되는 데 더 적합할 수 있지만, 세포의 움직임과 광표백으로 인해 최대 측정 시간이 제한됩니다. 여기에 제시된 데이터는 ~3-6분, 즉 200,000-400,000 라인 스캔을 위해 일상적으로 획득되었습니다.
- 검출기를 Photon 카운팅 모드로 설정합니다. Start Experiment를 눌러 획득을 시작합니다. 4.5-4.11단계를 반복하여 다른 셀을 측정합니다.
메모: 서로 다른 발현 수준에서 샘플당 10-15개의 세포를 측정하는 것이 좋습니다. (위험) 높은 발현 수준에서 검출기 포화를 피하십시오. 최대 카운트 속도는 ~1MHz를 초과해서는 안 됩니다.
- 올리고머 상태를 결정하기 위해 밝기 분석을 수행하는 경우 수정된 단계 4.1-4.11에 따라 호모이량체 밝기 보정 측정을 수행합니다.각 형광 단백질 호모이량체를 개별적으로(프로토콜 섹션 2를 사용하여 준비된 분리된 세포에서) 측정하고 하나의 스펙트럼 채널에서만 측정을 수행합니다.
