형질주입된 세포에서 효소 수용체 상호작용을 연구하기 위한 면역침전 분석

초록

출처: Strazza, M., et al. 수용체와 효소 간의 기능적 상호 작용을 연구하기 위한 Co-immunoprecipitation Assay. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오에서는 항 GFP 항체로 코팅된 비드를 사용하여 GFP 태그가 지정된 야생형 및 돌연변이 PD-1 단백질의 공동 면역침전을 수행하는 기술을 보여줍니다. bead-bound PD-1-GFP 단백질은 PD-1과 상호 작용하는 SHP2 단백질과 함께 배양되어 SHP2 상호 작용에서 중요한 역할을 하는 PD-1의 특정 구조 모티프를 식별할 수 있습니다.

프로토콜

1. 면역침전

참고: 다음 단계는 얼음 위 또는 4°C에서 수행해야 합니다.

1. 용해 완충액(pH 7.2, 250mM NaCl, 0.1% NP-40, 2mM EDTA, 10% 글리세롤에서 50mM Tris-HCl)에 프로테아제 억제제(10mL의 용해 완충액에 1정을 용해)와 1mM 오르토바나데이트 나트륨을 보충합니다. 500μL의 얼음처럼 차가운 용해 완충액을 세포에 추가하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 세포를 즉시 제거 및 수집합니다.
   메모: SHP2-transfected plate와 non-transfected control plate는 phosphatase 활성을 유지해야 하기 때문에 PD-1-GFP-transfected plate에 사용될 lysis buffer에만 sodium orthovanadate를 첨가하는 것이 중요합니다.
2. 용해물을 1.5mL 콜드 튜브로 옮기고 0.005 x g, 4°C에서 30분 동안 회전합니다.
3. 용해물에서 PNS(Post nuclei supertatent)를 수집하려면 4°C에서 10,000 x g에서 10분 동안 용해액을 스핀다운하고 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 버리십시오. 6개 플레이트로 구성된 두 번째 세트(그림 1)의 상등액을 얼음 위에 보관하여 나중에 전체 세포 용해물 분석을 수행할 수 있습니다.
4. 첫 번째 세트(플레이트 4개)의 PD-1-GFP-형질주입 용해물로부터 PD-1-GFP의 면역침전을 위한 항-GFP 비드의 제조(그림 1).
   1. 구슬이 가라앉는 것을 방지하려면 개봉하기 전에 구슬이 있는 병을 부드럽게 흔듭니다. 각 조건에 따라 슬러리에서 anti-GFP 비드 40μL를 제거합니다.
   2. 500 x g에서 4 °C에서 3 분 동안 회전하고 상층액을 제거하여 비드를 세척합니다 .
      메모: 손실을 방지하기 위해 피펫 플라스틱 팁과 아가로스 비드 사이의 접촉을 최소화하는 것이 중요합니다. 비드를 다른 튜브로 옮기기 전에 200μL 팁의 가장자리를 절단하는 것이 좋습니다.
   3. 80 μL의 lysis buffer(샘플당)에 비드를 재현탁합니다.
5. 세척된 비드를 첫 번째 세트(플레이트 4개)의 PD-1-GFP 발현 세포에서 세포 용해물(PNS)에 직접 추가합니다(단계 1.3). 4°C에서 30분 동안 0.005 x g로 회전하여 GFP 표지 단백질을 면역침강시킵니다.
6. 1mL의 저온 용해 완충액(오르토바나데이트 제외)으로 비드를 3회 세척합니다. 튜브를 2,500 x g에서 10 s.
   동안 원심분리합니다. 메모: 비드에 lysis buffer를 추가할 때 팁으로 비드를 건드리지 말고 비드에 직접 추가하십시오. 세탁하는 동안 위아래로 피펫을 만들 필요가 없습니다.
7. 마찬가지로, 첫 번째 세트(1개의 플레이트, 1.3단계)에서 활성 SHP2의 용해물을 나누고 세척된 PD-1-GFP 함유 비드의 3개의 튜브(WT PD-1-GFP 및 두 개의 서로 다른 인결핍 돌연변이, Y223F 및 Y248F)에 추가합니다. transfection되지 않은 세포의 용해물에서 부피의 1/3을 WT PD-1-GFP beads의 두 번째 tube에 추가합니다. 나머지 2/3는 버립니다.
8. 비드를 4°C에서 4시간 동안 부드럽게 회전시키면서(0.005 x g
) 배양합니다.
9. 1.6단계에서 보고된 대로 1mL의 저온 용해 완충액(pervanadate 또는 orthovanadate 없음)으로 비드를 두 번 세척합니다.
10. 샘플당 80μL의 용해 완충액(pervanadate 또는 orthovanadate 제외)을 추가하여 각 튜브의 총 부피가 100μL(20μL의 비드 및 80μL의 용해 완충액)가 되도록 합니다. 부드럽게 혼합하고 각 튜브에서 50μL를 두 개의 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
    메모: 이 단계를 수행하면 비드와 용해 완충액이 포함된 혼합물로 채워진 두 개의 튜브가 있습니다. 튜브 중 하나는 웨스턴 블로팅에 의한 공동 면역침전된 SHP2를 테스트하는 데 사용됩니다.

2. SHP2 웨스턴 블롯 분석

1. 비드를 스핀다운하고 상층액을 제거합니다.
2. 비드에 20μL의 2x Laemmli buffer(재료 표 참조)를 추가하고 95°C에서 5분 동안 끓입니다.
3. BCA 키트를 사용하여 입력 대조군(두 번째 세트)의 단백질 농도를 측정합니다(재료 표 참조). 가장 희석된 시료 30μL를 새 튜브로 옮깁니다. 용해 완충액이 있는 나머지 입력 대조군을 가장 희석된 샘플과 동일한 농도로 희석하고 각각에서 30μL를 새 튜브로 옮깁니다.
   메모: 이 단계를 수행하면 각각 30μL의 유사한 단백질 농도를 가진 4개의 튜브가 생성되어 입력 제어 용해물을 나타냅니다.
4. 용해물에 동일한 부피의 2x Laemmli 완충액을 추가하고 95 °C에서 5 분 동안 끓입니다. 비드를 스핀 다운하고 웨스턴 블롯 분석을 위해 4-20 % SDS-PAGE Tris 기반 겔 (재료 표 참조)에 상등액을 로드합니다. 또한 두 번째 세트의 각 샘플에서 50μL를 로드합니다.
5. 웨스턴 블롯 분석을 계속합니다.

결과

그림 1: 실험 조건 및 전략. HEK 293T 세포에서 GFP-PD-1 WT (야생형), GFP-PD-1 Y223F (ITIM 돌연변이), 또는 GFP-PD-1 Y248F (ITSM 돌연변이)를 발현시킨 후 퍼바나데이트로 처리하였다. GFP 면역침전으로 수집된 인산화된 GFP-PD-1 단백질을 SHP2를 과발현하는 세포의 용해물과 혼합하고, PD-1의 각 버전에 결합된 SHP2의 수준과 활성을 기록했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
니트로셀룰로오스 멤브레인	제너럴 일렉트릭	10600004
마이크로 원심분리기	에펜도르프	5424-R	1.5 밀리리터
BCA (영어)	어부	23225	Bi Cinchoninic Acid 분석
안티 SHP2	산타 크루즈	사우스 캐롤라이나-280
안티-GFP-아가로스	증권 시세	D153-8
안티 GFP	로슈	118144600
안티 액틴	산타 크루즈	사우스 캐롤라이나-1616
HEK-293 세포	증권 시세	CRL-1573
오르토바나데이트	시그마	S6508
프로테아제 억제제 칵테일	로슈	11836170001	EDTA 무함유
Tris-Glycine SDS 시료 완충액(2x)	인비트로젠	LC2676	수정된 Laemmli 버퍼
4-20% 트리스-글리신 미니 젤	인비트로젠	XP04205BOX	15웰
트립신-EDTA(0.25%) 페놀 레드	지브코	25200114
염화나트륨	시그마	S7653	소금

사이즈 년 표시기 (영어) 표시기