미끼와 먹이 단백질 간의 상호 작용을 분석하기 위한 ELISA 기반 방법

Abstract

출처: Singh, B. et al., 세균 접착 및 혈청 저항성에서 비트로넥틴의 역할을 연구하기 위한 분석. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 고정되지 않은 첫 번째 단백질에 대한 두 번째 단백질의 결합을 측정하여 두 단백질 간의 단백질-단백질 상호 작용을 감지하는 ELISA 기반 기술에 대해 설명합니다. 결합된 두 번째 단백질은 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)와 같은 효소로 표지된 특정 항체를 사용하여 검출됩니다.

Protocol

1. 재조합 PH와 Vn 간의 상호 작용에 대한 ELISA 분석

참고: 불특정 바인딩을 제외하려면 컨트롤을 포함해야 합니다. 인간 인자 H(FH) 또는 C4b 결합 단백질(C4BP)은 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용됩니다.

1. 각 인간 단백질(Vn, FH 및 C4BP)을 Tris-HCl, pH 9.0(코팅 완충액)에서 50nM로 개별적으로 희석합니다. 100μL의 단백질 용액을 Polysorp 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 뚜껑이 있는 플레이트를 닫고 4°C에서 하룻밤(16시간) 동안 보관하면 단백질이 마이크로타이터 플레이트 웰에 고정될 수 있습니다.
2. 마이크로타이터 플레이트에서 용액을 싱크대 위로 거꾸로 기울여 버리고 300μL의 PBS/웰로 웰을 세 번 세척합니다. 2.5%(w/v) BSA(PBS-BSA)를 함유한 PBS로 RT에서 1시간 동안 코팅된 웰을 차단합니다.
3. 차단 용액을 제거한 후 웰당 0.05%(v/v) Tween 20(PBST)을 함유한 PBS 300μL로 웰을 3회 세척합니다. 각 샘플 웰에 100μL의 50nM 재조합 His-태그 PH를 추가하고 RT에서 1시간 동안 배양합니다. 대조군 웰에 PBS-BSA를 100μL만 추가합니다.
   메모: Hif로부터 PH를 암호화하는 lph 유전자를 PCR에 의해 증폭하고 발현된 단백질의 C-말단에 6× His 태그를 추가하는 pET26b 발현 벡터로 복제했습니다. 재조합 벡터는 발현을 위해 E. coli BL21(DE3)로 형질전환되었습니다. Ni-NTA 수지를 사용하여 재조합 단백질을 정제하였다.
4. 단백질 용액을 버리고 웰당 300μL의 PBST로 웰을 세 번 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거합니다. 양고추냉이 과산화효소(HRP)가 결합된 항-His pAbs(1:10,000 희석)를 함유한 PBS-BSA 100μL를 첨가하고 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
5. 5% 아세톤과 45% 메탄올 용액에 테트라메틸벤지딘을 용해시켜 20mM 용액 A를 준비합니다. 용액 B를 준비하려면 1,000mL의_H2O에 구연산 19.2g을 용해시키고 KOH를 첨가하여 pH를 4.25로 조정한 다음 30%_H2O2230μL를 첨가합니다. RT에서 어두운 곳에 두 솔루션을 모두 보관하십시오. 사용 직전에 500μL의 용액 B와 9.5mL의 용액 A를 혼합하여 ELISA 검출 시약을 준비합니다.
6. 웰당 300μL의 PBST로 웰을 3회 세척하고 각 웰에 100μL의 ELISA 검출 시약을 첨가하여 항원-항체 복합체를 검출합니다.
7. 1 M H₂SO₄/well 50 μL를 첨가하여 반응을 중지합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 웰의 광학 밀도를 측정합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AR2G 센서	Pall 생명과학	제18-5095	아미노 커플링에 의한 고정된 단백질에 대한 센서
아세톤	폭스바겐	제97064-786	분석 등급
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치	A2058 (영어	세포 배양에 적합
C4BP (C4B 결합 단백질)	보완 기술, Inc.	대답109	냉동 액체 형태로 구입
구연산	시그마-알드리치	251275-500지	미국 화학 학회(ACS) 등급
HRP-conjugated anti-His tag 항체	아브캠	ab1269	다클론성
C4BP	보완 기술, Inc.	대답109	냉동 용액
히스티딘 친화성 수지 컬럼 (HisTrap HP)	GE 헬스케어 생명과학	Tel.: 17-5247-01	Ni Sepharose로 사전 충전된 컬럼
His-태그가 지정된 PH			실험실에서 재조합적으로 발현되고 정제됨
메탄노	폭스바겐	BDH1135-1LP	분석 등급
백본에 C-말단 6x His-tag를 함유한 플라스미드 (pET26(b))	노바젠	69862-3	DNA 벡터
Polysorb 마이크로타이터 플레이트	시그마-알드리치	M9410	ELISA의 경우
테트라메틸벤지딘	시그마-알드리치	860336-100MG	ELISA 등급
인간 혈장에서 추출한 비트로넥틴(Vn)	시그마-알드리치	V8379-50UG	세포 배양 등급