미끼와 먹이 단백질 간의 상호 작용을 분석하기 위한 ELISA 기반 방법

초록

출처: Singh, B. et al., 세균 접착 및 혈청 저항성에서 비트로넥틴의 역할을 연구하기 위한 분석. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 고정되지 않은 첫 번째 단백질에 대한 두 번째 단백질의 결합을 측정하여 두 단백질 간의 단백질-단백질 상호 작용을 감지하는 ELISA 기반 기술에 대해 설명합니다. 결합된 두 번째 단백질은 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)와 같은 효소로 표지된 특정 항체를 사용하여 검출됩니다.

프로토콜

1. 재조합 PH와 Vn 간의 상호 작용에 대한 ELISA 분석

참고: 불특정 바인딩을 제외하려면 컨트롤을 포함해야 합니다. 인간 인자 H(FH) 또는 C4b 결합 단백질(C4BP)은 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용됩니다.

1. 각 인간 단백질(Vn, FH 및 C4BP)을 Tris-HCl, pH 9.0(코팅 완충액)에서 50nM로 개별적으로 희석합니다. 100μL의 단백질 용액을 Polysorp 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 뚜껑이 있는 플레이트를 닫고 4°C에서 하룻밤(16시간) 동안 보관하면 단백질이 마이크로타이터 플레이트 웰에 고정될 수 있습니다.
2. 마이크로타이터 플레이트에서 용액을 싱크대 위로 거꾸로 기울여 버리고 300μL의 PBS/웰로 웰을 세 번 세척합니다. 2.5%(w/v) BSA(PBS-BSA)를 함유한 PBS로 RT에서 1시간 동안 코팅된 웰을 차단합니다.
3. 차단 용액을 제거한 후 웰당 0.05%(v/v) Tween 20(PBST)을 함유한 PBS 300μL로 웰을 3회 세척합니다. 각 샘플 웰에 100μL의 50nM 재조합 His-태그 PH를 추가하고 RT에서 1시간 동안 배양합니다. 대조군 웰에 PBS-BSA를 100μL만 추가합니다.
   메모: Hif로부터 PH를 암호화하는 lph 유전자를 PCR에 의해 증폭하고 발현된 단백질의 C-말단에 6× His 태그를 추가하는 pET26b 발현 벡터로 복제했습니다. 재조합 벡터는 발현을 위해 E. coli BL21(DE3)로 형질전환되었습니다. Ni-NTA 수지를 사용하여 재조합 단백질을 정제하였다.
4. 단백질 용액을 버리고 웰당 300μL의 PBST로 웰을 세 번 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거합니다. 양고추냉이 과산화효소(HRP)가 결합된 항-His pAbs(1:10,000 희석)를 함유한 PBS-BSA 100μL를 첨가하고 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
5. 5% 아세톤과 45% 메탄올 용액에 테트라메틸벤지딘을 용해시켜 20mM 용액 A를 준비합니다. 용액 B를 준비하려면 1,000mL의_H2O에 구연산 19.2g을 용해시키고 KOH를 첨가하여 pH를 4.25로 조정한 다음 30%_H2O2230μL를 첨가합니다. RT에서 어두운 곳에 두 솔루션을 모두 보관하십시오. 사용 직전에 500μL의 용액 B와 9.5mL의 용액 A를 혼합하여 ELISA 검출 시약을 준비합니다.
6. 웰당 300μL의 PBST로 웰을 3회 세척하고 각 웰에 100μL의 ELISA 검출 시약을 첨가하여 항원-항체 복합체를 검출합니다.
7. 1 M H₂SO₄/well 50 μL를 첨가하여 반응을 중지합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 웰의 광학 밀도를 측정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
AR2G 센서	Pall 생명과학	제18-5095	아미노 커플링에 의한 고정된 단백질에 대한 센서
아세톤	폭스바겐	제97064-786	분석 등급
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치	A2058 (영어	세포 배양에 적합
C4BP (C4B 결합 단백질)	보완 기술, Inc.	대답109	냉동 액체 형태로 구입
구연산	시그마-알드리치	251275-500지	미국 화학 학회(ACS) 등급
HRP-conjugated anti-His tag 항체	아브캠	ab1269	다클론성
C4BP	보완 기술, Inc.	대답109	냉동 용액
히스티딘 친화성 수지 컬럼 (HisTrap HP)	GE 헬스케어 생명과학	Tel.: 17-5247-01	Ni Sepharose로 사전 충전된 컬럼
His-태그가 지정된 PH			실험실에서 재조합적으로 발현되고 정제됨
메탄노	폭스바겐	BDH1135-1LP	분석 등급
백본에 C-말단 6x His-tag를 함유한 플라스미드 (pET26(b))	노바젠	69862-3	DNA 벡터
Polysorb 마이크로타이터 플레이트	시그마-알드리치	M9410	ELISA의 경우
테트라메틸벤지딘	시그마-알드리치	860336-100MG	ELISA 등급
인간 혈장에서 추출한 비트로넥틴(Vn)	시그마-알드리치	V8379-50UG	세포 배양 등급

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