단백질-단백질 상호작용을 위한 β-Lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay

초록

출처: Vandevenne, M., et al. 생체 분자 상호 작용을 감지하기 위한 β-lactamase 기반 전도성 측정 바이오센서 분석의 사용. J. Vis. 특급. (2018년)

이 비디오는 트랜스듀서 칩에 고정된 표적 항원과 항체의 상호 작용을 연구하기 위한 전도도 측정 바이오센서 분석을 보여줍니다. 바이오센서는 고정되지 않은 표적 항원에 결합하기 위해 나노바디에 융합된 기능적 촉매 부위가 있는 β-락타마제 효소인 이중 기능 키메라 단백질을 갖도록 설계되었습니다. 결합시 β-락타마제 효소에 의한 항생제 기질의 촉매 가수분해는 전기 신호를 생성하여 항원-항체 상호 작용을 확인합니다.

프로토콜

1. 단백질 시료 준비

1. 이전 연구에서 보고된 바와 같이 하이브리드 단백질 BlaP-cAb-Lys3를 생성하고 정제합니다. 다음 구성으로 pH 7.4의 50mM 인산염 완충액에 단백질을 보관하십시오 : NaCl 8g, KCl 0.2g, Na₂HPO₄ 1.44g 및 KH₂PO₄ 0.24g을 증류수 800mL에 용해 용액의 최종 부피를 1L로 조정하기 전에 용액의 pH를 7.4로 고정하십시오. 필터는 단백질 용액을 살균합니다.
2. 암탉 달걀 흰자 라이소자임(HEWL) 스톡 용액을 준비합니다. 시중에서 판매되는 HEWL 100mg(40,000 units/mg)을 10mL의 인산염 완충액 식염수에 용해시킵니다(PBS는 2.1.1단계 참조). 0.22μm 컷오프가 있는 필터를 사용하여 여과하여 단백질 용액을 살균합니다.

2. 바이오센서 분석

1. 용액 및 완충액 준비
   1. 800 mL의 증류수에 NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na₂HPO₄ 1.44 g, KH₂PO₄ 0.24 g을 용해하여 50 mM PBS를 준비한다. 용액의 부피를 7.4L로 조정하기 전에 1N HCl 또는 1N NaOH로 pH 1로 조정하십시오.필터 멸균 및 4 °C에서 보관하십시오.
   2. 위와 같이 준비된 PBS 100mL에 카제인 가수분해물 3g을 용해시켜 포화/차단 용액을 준비합니다(2.1.1단계 참조). 필터는 멸균하고 4 °C에서 보관하십시오.
   3. 상기와 같이 제조된 PBS 100mL에 카제인 가수분해물 1g을 용해하여 결합 용액을 준비합니다(2.1.1 단계 참조). 필터는 멸균하고 4 °C에서 보관하십시오.
   4. 상기와 같이 제조된 PBS 100mL에 Tween 20(100%) 100μL를 첨가하여 세척 용액(0.1% Tween - PBS)을 준비합니다(단계 2.1.1 참조). 4 °C에서 보관하십시오.
   5. 상술한 바와 같이 제조된 PBS 100mL에 Triton X-100 1mL(100%)를 첨가하여 전극 준비 용액(1% Triton X-100 - PBS)을 준비합니다(2.1.1 단계 참조). 4 °C에서 보관하십시오.
   6. 26g의 KCl을 증류수에 100mL의 최종 부피로 용해하여 전극 재생 용액(3.5M KCl)을 준비합니다. 필터를 멸균하고 4 °C에서 보관하십시오.
   7. 0.29g의 NaCl을 증류수에 1L의 최종 부피로 용해시켜 5mM NaCl 용액을 준비합니다.필터는 4°C에서 멸균 및 보관합니다. 그런 다음 26.7mg의 벤질페니실린을 5mM NaCl 용액 20mL에 용해시켜 검출 용액(4mM 벤질페니실린)을 준비합니다. 필터는 -20 °C에서 살균 및 보관하십시오.
2. 센서 준비 및 재생
   메모: 폴리아닐린 코팅된 센서 칩은 P. Bogaerts 박사, S. Yunus 박사 및 Y. Glupczynski 교수(Louvain-la-Neuve 가톨릭 대학교 - CHU Mont-Godinne)에 의해 개발되어 친절하게 제공되었습니다. 센서에 대한 설명과 이러한 센서를 합성하는 데 사용되는 폴리아닐린 전기 중합 프로토콜은 이전 작업에 자세히 설명되어 있습니다. 간단히 말해서, 이 시스템은 고전적인 인쇄 회로 기판(PCB) 기술로 제조된 8개의 개별 칩으로 구성된 재사용 가능한 센서를 사용합니다. 개별 칩은 3개의 전극 원형 스폿으로 구성됩니다. 맨 위는 폴리아닐린이 전기 합성된 작동 전극입니다. 중간은 기준 전극이고 하단 전극은 상대 전극을 구성합니다. 기준 전극과 상대 전극은 모두 탄소층 위에 고체 Ag/AgCl 아말감을 사용하여 기능화됩니다.
   1. 300μL/웰의 전극 준비 용액(1% Triton X-100 - PBS, 2.1.5단계 참조)이 포함된 96웰 플레이트의 웰에 팁을 담궈 전극을 3회 세척합니다. 실온에서 부드럽게 혼합하면서 2분 동안 세탁할 때마다 수행합니다.
   2. 실온에서 부드럽게 혼합하면서 300μL/웰의 증류수가 들어 있는 96웰 플레이트의 웰에 팁을 2분 동안 담궈 전극을 헹굽니다.
   3. 300μL/웰의 재생 용액(3.5M KCl, 단계 2.1.6 참조)이 포함된 96웰 플레이트의 웰에 팁을 4°C 또는 실온에서 1시간 동안 담가 전극을 재생합니다.
   4. 300μL/웰의 인산염 완충액 식염수가 포함된 96웰 플레이트의 웰에 팁을 담궈 전극을 3회 세척합니다(2.1.1단계 참조). 실온에서 부드럽게 혼합하면서 2분 동안 세탁할 때마다 수행합니다.
3. 센서에서 수행된 결합 분석
   1. PBS에서 준비된 40μg/mL HEWL 15μL 방울을 전극 표면에 증착하여 전극의 PANI(폴리아닐린) 표면에 HEWL을 코팅합니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 또는 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.
   2. 센서 칩의 전극 부분을 300μL/웰의 인산염 완충 식염수가 포함된 96웰 플레이트의 웰에 담궈 인산염 완충액 식염수로 전극을 3회 세척합니다(단계 2.1.1 참조). 실온에서 부드럽게 혼합하면서 2분 동안 세탁할 때마다 수행합니다.
   3. 전극 표면에 차단 용액의 50μL 방울(단계 2.1.2 참조)을 추가하여 전극을 포화시킵니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 이전 단계에서 설명한 대로 세 번 세탁합니다(2.3.2단계 참조).
   4. 결합 용액에서 BlaP-cAb-Lys3 용액을 20μg/mL로 희석하고(단계 2.1.3 참조) 이 희석된 용액을 전극에 15μL 방울 떨어뜨립니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다. 항원-나노바디 반응 후 세척액을 사용하여 이전 단계에서 설명한 대로 3회 세척합니다(2.1.4단계 참조). 그런 다음 PBS로 전극을 한 번 헹굽니다(2.1.1단계 참조).
   5. 감지를 위해 구리 회로 부분을 통해 센서 칩을 디지털 멀티미터에 꽂습니다. 그런 다음 양극에 50μL 방울의 검출 용액(2.1.7 단계 참조)을 적용하고 음극에 50μL 방울의 NaCl 5mM 용액을 적용하여 센서 응답을 시작합니다(2.1.7 단계 참조). 실온에서 30분 동안 배양합니다. 디지털 멀티미터로 컨덕턴스를 모니터링합니다.
      메모: 멀티미터는 P. Bogaerts 박사, S. Yunus 박사 및 Y. Glupczynski 교수(Louvain-la-Neuve 가톨릭 대학교 - CHU Mont-Godinne. 이 전위차는 USB 포트를 통해 컴퓨터로 제어되며 센서의 8개 칩을 동시에 분석합니다. Yunus와 동료들이 만든 소프트웨어는 시간에 대한 기준 전극과 샘플 전극 간의 전도도 차이를 측정한 값을 나타내는 실시간 플롯을 생성합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
KH2사서함4	시그마-알드리치	V000225
케이2HPO4	시그마-알드리치	1551128
염화나트륨	시그마-알드리치	S7653
트리스-HCl	로슈	10812846001
에디타	시그마-알드리치	E9884
케이클	시그마-알드리치	P9541
나2HPO4	시그마-알드리치	NIST2186II
2-메르캅토에탄올	시그마-알드리치	M6250
알라닌	시그마-알드리치	A7627
HClO4 (HClO 4	플루카	34288	1M HClO4 솔루션, 유통업체 : Sigma-Aldrich
카제인 가수분해물	시그마-알드리치	22090
벤질페니실린 나트륨	시그마-알드리치	B0900000
암탉 달걀 흰자 라이소자임	로슈	10837059001
헵탄	시그마-알드리치	246654
메탄올	시그마-알드리치	322415
수산화암모늄 용액	시그마-알드리치	380539	28% NH3 in H2O, 이중 증류에 의해 정제 (집중?)
실험실 소모품
6웰 플레이트	Greiner 바이오 원	657165	CELLSTAR 6웰 플레이트
설비
pH 측정기	무슨일보	AN-번호 AN-번호 AA110	실험실 pH 측정기 inoLab pH 7110
진공 및 여과 시스템	날진	NALG300-4100	수신기가 있는 필터 홀더, 분배기 : VWR
전위차 센서 칩			Yunus와 동료들이 제조했습니다(참조 16).
PGSTAT30 Autolab	메트로옴 오토랩		단종된 후속 Autolab PGSTAT302N
디지털 멀티미터, METRAHit 22M	고센 메트라와트		단종, 후속 Metrahit Base

(영문) ) 년