1. 셀
- 절차를 시작하기 2일 전에 실험 당일에 합류할 수 있도록 필요한 밀도로 세포를 플레이트링합니다. 플라스크 또는 플레이트에 세포를 플레이트합니다. 그러나 플레이트에서 단백질을 추출하는 것이 더 쉬울 것입니다. 결과가 일관되도록 실험당 조건당 조건당 78cm2 플라스크 플레이트 4개 또는 150cm2 플라스크 2개 이상을 준비하는 것이 편리합니다.
- 이 연구에서는 Pollard et al.에 의해 기술된 바와 같이 2% B27, 1% N2, 20ng/mL EGF 및 b-FGF가 보충된 RHB-A 줄기 세포 배지에서 배양된 150cm2의 4개 플라스크에 있는 플레이트 인간 G166 GSC를 생성합니다. 합류점에 도달했을 때의 프로세스입니다. 예를 들어, 5 x 106 G166 셀을 150cm2 플라스크에 도금한 경우 도금 후 2일 후에 처리했습니다.
2. 비오틴화 CPP
- 동결건조된 비오틴화 CPP(BCPP)가 들어 있는 바이알을 8200 x g에서 30초 동안 회전시켜 뚜껑에 분말이 남아 있지 않도록 합니다. 컨트롤 BCPP를 포함하여 발견된 상호 작용이 대상 시퀀스와 관련이 있는지 확인합니다. 본 연구에서 대조군 BCPP는 TAT비오틴(TAT-B)이었고, 치료제 BCPP는 TAT-Cx43266-283-B였다. 비오틴에 결합된 스크램블 또는 돌연변이 단편에 융합된 TAT와 같은 다른 대조군을 사용할 수 있습니다.
- BCPP를 제조업체가 표시한 원액에 해당 배양 배지에 용해시킵니다. 예를 들어, GSC를 처리하기 위해 2mg/mL BCPP의 원액을 얻으려면 1mg의 BCPP를 함유한 하나의 바이알에 0.5mL의 GSC 배양 배지를 첨가합니다. 와류를 일으키고 펩타이드가 잘 용해되었는지 확인하십시오.
3. 튜브
참고: 섹션에서 요구하는 조건에 따라 최소 12개의 1.5 mL 튜브를 준비하십시오.
- 조건별로 처음 3개의 튜브를 표시합니다. 그들은 6.4단계에서 얻은 세포 용해물의 총 부피를 갖게 됩니다.
- 조건별 3개의 튜브에 A를 표시합니다. 이 튜브는 세포 용해물을 용해하고 회전시킨 후 얻은 첫 번째 상등액을 갖습니다(7.2단계).
- 조건별 3개의 튜브에 A를 표시합니다. 이 튜브에는 첫 번째 상층액의 작은 분취량이 있습니다. 이러한 용해물은 7.3단계에서 웨스턴 블롯 샘플로 사용됩니다.
- 조건별 3개의 튜브에 C를 표시합니다. 이 튜브에는 NeutrAvidin으로 풀다운 한 후 얻은 상층액이 있습니다 (7.7.
단계
메모: 이것은 웨스턴 블롯이 단백질에 대한 신호를 보이지 않는 경우, 즉 단백질이 절차의 일부 단계에서 당겨지거나 손실되지 않은 경우에 중요합니다. 이런 상황이라면 이 과정을 반복하여 단백질을 끌어내린다.
4. BCPP를 이용한 세포 치료
- 배양 배지를 흡인합니다.
- 배양 시간에 따라 가능한 가장 작은 부피의 배지로 BCPP를 배양하는 데 필요한 해당 부피의 새 배지를 교체하십시오. 어쨌든 배지가 플레이트/플라스크의 전체 표면을 완전히 덮어 세포가 건조되지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다(예: 30분 배양 동안 150cm2당 6mL).
- BCPP의 원액 부피를 세포 배양액에 추가하여 효과적인 것으로 입증된 농도에 도달합니다. 이 연구에서 50μM TAT-Cx43266-283-B는 GSC 증식을 감소시키는 것으로 입증되었습니다.
- 따라서 배양 배지 mL당 92.8μL의 2mg/mL TAT-Cx43266-283-B(MW=3723.34g/mol)를 추가하여 50μM TAT-Cx43266-283-B의 최종 농도를 얻습니다. 추가할 부피가 대조군 펩타이드에 대해 다른 경우, 동일한 최종 부피까지 배양 배지로 완료합니다. 예를 들어, 49.1 μL TAT-B(MW=1914.31 g/mol) 및 43.7 μL GSC 배지를 배양 배지 mL당 첨가하여 50 μM TAT-B의 최종 농도를 얻었습니다.
- 세포를 37°C 및 5% CO2의 인큐베이터에 30분 동안 놓고 BCPP와 세포 내 파트너 간의 상호 작용이 일어나는지 확인합니다. 상호 작용이 더 오래 걸리면 더 오래 배양하거나 실험이 시간 경과로 구성된 경우 시간을 조정합니다. 또한, 관심의 상호 작용은 다양한 세포 내 신호 전달 경로를 자극함으로써 촉진되거나 예방될 수 있습니다.
5. 버퍼 및 솔루션
- PBS pH 7.4 : 136 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O; 1.7 mM KH2PO4를 준비한다.
- 단백질 용해 완충액 준비 : 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, 1 % IGEPAL, 사용하기 전에 다음을 추가하십시오 : 1/100 (v / v) 프로테아제 억제제 칵테일, 1 mM 불화 나트륨, 1 mM 페닐 메탄 설포닐 플루오 라이드 (PMSF) 및 0.1 mM 오르토 바나 데이트 나트륨.
- Laemmli 완충액 준비 : (4x : 0.18 M Tris-HCl pH 6.8, 5 M 글리세롤, 3.7 % SDS (p / v), 0.6 M β- 메르 캅토 에탄올 또는 9 mM DTT, 0.04 % (v / v) 브로 모 페놀 블루 (BB)).
6. 단백질 추출
참고: 단백질 추출은 앞서 설명한 대로 수행되었습니다. 절차의 이 전체 섹션을 4°C에서 수행합니다.
- 배양 배지를 완전히 흡인합니다.
- 세포 분리를 방지하기 위해 150cm2당 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 3 x 10mL를 매우 조심스럽게 세척합니다.
- 세포 용해물을 얻으려면 150cm2 당 3mL의 용해 완충액을 추가하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 표면을 철저히 긁어냅니다. 플레이트/플라스크를 약 45도로 기울이면 세포 용해물을 해당 튜브에 더 쉽게 모을 수 있습니다.
- 튜브당 1mL의 세포 용해물을 3개의 1.5mL 튜브에 붓습니다. 이 튜브에는 3.1단계에 표시된 대로 조건과 반복이 표시됩니다.
7. 풀다운
- 1.5mL 튜브를 11,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
- 상등액을 새 튜브(A)로 옮깁니다.
- 조건별로 이 상등액의 부분 표본을 다른 튜브(B)에 가져갑니다(즉, 튜브당 50μL). 4x Laemmli 완충액(50μL 용해물의 경우 16.6μL)을 추가하고 -20°C에서 동결합니다. 이러한 용해물은 일반적인 웨스턴 블롯 샘플로 사용됩니다.
- 부드러운 쉐이킹으로 NeutrAvidin Agarose를 매우 잘 균질화합니다. 피펫 팁의 끝을 잘라 직경을 늘리고 비드의 피펫팅을 개선합니다. (A) 튜브에 세포 용해물 mL당 50μL의 NeutrAvidin Agarose를 추가합니다.
- 4°C에서 매우 부드럽게 흔들어 하룻밤 동안 배양하여 NeutrAvidin이 세포 내 파트너에 결합된 BCPP와 상호 작용할 수 있도록 합니다.
- 3,000 x g에서 4°C에서 1분 동안 원심분리기를 사용하여 단백질이 있는 NeutrAvidin 복합체를 수집합니다.
- 상층액을 조심스럽게 제거하고 깨끗한 튜브(C)로 옮깁니다. 풀다운이 성공하지 못할 경우를 대비하여 사용할 수 있도록 보관하십시오.
- 세척 단계: 펠릿(튜브 A)에 새로운 용해 완충액을 추가하고 반전으로 재현탁한 다음 7.6 및 7.7 단계를 5회 더 반복합니다. 이러한 모든 상등액은 폐기할 수 있습니다.
- 상층액을 제거하고 원하는 최종 부피(confluent cell의 cm2 플라스크에서 얻은 펠렛의 경우 1.5mL 튜브당 40μL)에 2x Laemmli 완충액을 추가합니다.
- 100°C에서 5분 동안 용리하여 8,200 x g에서 30초 동안 단백질과 원심분리기 간의 상호 작용을 해리하여 NeutrAvidin 비드를 펠릿화합니다.
- 해리된 단백질을 포함하는 상등액을 모세관 팁과 함께 새 튜브(D)로 가져갑니다. 반복적인 용리 단계가 필요한 경우를 대비하여 비드를 보관할 수 있습니다.
메모: 상등액(튜브 D)은 이제 웨스턴 블롯에 적재하거나 -20°C에서 동결할 준비가 되었습니다.
