효모 세포에서 단백질 자가 결합을 결정하기 위한 Yeast Two-Hybrid Assay

초록

출처: Stanczyk, P. J., et al., 단백질 올리고머화의 생체 내 및 체외 평가를 위한 유전 및 생화학적 접근: 라이언노딘 수용체 사례 연구. J. Vis. 특급. (2016년)

이 동영상은 특정 단백질 자가 상호작용을 검출하기 위한 효모 2-하이브리드 분석을 보여줍니다. 이 분석에서 관심 단백질은 β-갈락토시다아제 효소를 암호화하는 전사 인자의 두 도메인에 태그가 지정됩니다. 두 단백질이 상호 작용할 때 전사와 번역이 효소를 형성하게 된 다음 생화학적 분석을 사용하여 검출됩니다.

프로토콜

1. 효모 형질전환

1. RT에서 5분 동안 1,500 x g에서 원심분리(50ml 튜브)로 효모를 수확합니다. 상등액을 버리고 각 펠릿을 5ml의 멸균 H₂O에 재현탁한 다음 함께 풀링합니다.
2. RT에서 5분 동안 1,500 x g에서 다시 원심분리하고 상층액을 버립니다. 갓 준비한 멸균 1x LiAc/TE.
   1ml에 효모 펠릿을 재현탁합니다. 메모: 제제 후 1시간 이내에 유능한 효모 세포를 사용하십시오.
3. 단일 형질전환을 위해 200 ng의 플라스미드 DNA 또는 동시 형질전환을 위해 각 플라스미드 DNA 0.5 - 1 μg을 첨가하고, 청어 고환 운반체 DNA 100 μg(20분 동안 끓여서 사용 직전 얼음에서 식힘)을 첨가하여 플라스미드 샘플(1.5 ml 튜브)을 준비합니다.
   참고: 양성 대조군(예: pVA3와 동시 형질전환된 효모(p53 단백질을 사용한 GAL4 DNA-BD 융합 인코딩) 및 pTD1(SV40 대형 T 항원을 사용한 GAL4 AD 융합 인코딩)을 포함합니다.
4. 갓 준비한 유능한 효모 현탁액 100μl와 1x LiAc/PEG 용액 600μl(스톡 PEG 3350 8ml, 스톡 TE 1ml, 스톡 LiAc 1ml)를 추가하고 ~30초 동안 와류를 넣습니다.30°C에서 200rpm으로 진탕하면서 30분 동안 배양합니다.
5. 80μl의 dimethyl sulfoxide(최종 농도 10% v/v)를 넣고 부드러운 반전으로 잘 혼합합니다. 42 °C 수조에서 15 분 동안 열 충격을 가하면서 2-3 분마다 혼합합니다.
6. 세포 현탁액을 얼음 위에서 2분 동안 냉각하고 실온에서 14,000 x g으로 15초 동안 원심분리하여 효모를 회수합니다.
7. 세포 펠릿을 100μl의 1x TE에 재현탁시키고 선택적 성장을 위해 적절한 최소 SD 배지 플레이트(미끼 및 타겟 플라스미드 모두에 대한 선택적 압력을 유지하기 위해 류신 및 트립토판이 없는 배지)에 플레이트를 재현탁합니다.
8. 콜로니의 직경이 ~2mm가 될 때까지 30°C에서 플레이트를 거꾸로 배양합니다(보통 4 - 5일). 플레이트는 4 ° C에서 2-3 주 동안 보관할 수 있습니다. 더 오래 보관하려면 글리세롤 재고를 만들고 -80 °C에서 보관하십시오 .
   메모: 미끼 및 표적 단백질이 면역 블로팅에 의해 효모에서 발현되는지, 그리고 효모에서 별도로 발현될 때 자율 리포터 유전자 활성화가 없는지 확인합니다.
9. 갓 준비한 유능한 효모 현탁액 100μl와 1x LiAc/PEG 용액 600μl(스톡 PEG 3350 8ml, 스톡 TE 1ml, 스톡 LiAc 1ml)를 추가하고 ~30초 동안 와류를 넣습니다.30°C에서 200rpm으로 진탕하면서 30분 동안 배양합니다.
10. 80μl의 dimethyl sulfoxide(최종 농도 10% v/v)를 넣고 부드러운 반전으로 잘 혼합합니다. 42 °C 수조에서 15 분 동안 열 충격을 가하면서 2-3 분마다 혼합합니다.
11. 세포 현탁액을 얼음 위에서 2분 동안 냉각하고 실온에서 14,000 x g으로 15초 동안 원심분리하여 효모를 회수합니다.
12. 세포 펠릿을 100μl의 1x TE에 재현탁시키고 선택적 성장을 위해 적절한 최소 SD 배지 플레이트(미끼 및 타겟 플라스미드 모두에 대한 선택적 압력을 유지하기 위해 류신 및 트립토판이 없는 배지)에 플레이트를 재현탁합니다.
13. 콜로니의 직경이 ~2mm가 될 때까지 30°C에서 플레이트를 거꾸로 배양합니다(보통 4 - 5일). 플레이트는 4 ° C에서 2-3 주 동안 보관할 수 있습니다. 더 오래 보관하려면 글리세롤 재고를 만들고 -80 °C에서 보관하십시오 .
    참고: 미끼 및 표적 단백질이 면역 블로팅에 의해 효모에서 발현되는지, 그리고 효모에서 별도로 발현될 때 자율적인 리포터 유전자 활성화가 없는지 확인합니다.

2. 콜로니 리프트 여과지 β-Gal 분석

1. 다음 버퍼를 준비합니다.
   1. 100 mM_Na2HPO4, 40 mM_NaH2PO4, 10 mM KCl, 및 1 mM MgSO4를 함유하는 Z-완충액을 제조하고, pH를 7.4로 조정한다. 오토클레이브로 살균하고 RT에 보관하십시오.
   2. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside를 N,N-dimethylformamide에 20mg/ml로 용해하여 X-Gal 완충액을 준비하고 -20°C의 암흑에 보관합니다.Z 완충액/X-Gal 용액을 준비합니다. Z-버퍼에서 0.33mg/ml의 X-Gal과 0.27% v/v의 β-메르캅토에탄올을 혼합하여 사용 전에 완충액을 만드십시오. 샘플당 2.5ml를 사용하십시오.
2. 깨끗한 2.5mm 플레이트에 갓 준비한 Z 버퍼/X-Gal 용액 100ml를 넣고 셀룰로오스 여과지 안에 넣습니다.
3. 분석할 효모 콜로니가 있는 플레이트 표면 위에 새 여과지를 놓습니다. 집게로 여과지를 플레이트에 부드럽게 문지르고 집락이 부착될 때까지 ~5분 동안 그대로 둡니다.
   메모: 양성 대조군을 병렬로 처리, 즉 pVA3 및 pTD1과 함께 형질전환된 효모를 처리합니다.
4. 여과지를 들어 올려 30초 동안 액체 질소 풀에 담그십시오(집게 사용). 얼어붙은 여과지를 RT에서 ~2분 동안 해동시킵니다.
5. 100mm 플레이트 내부의 미리 적신 여과지 위에 여과지(콜로니 면이 위로 향하게)를 놓고 30°C에서 배양합니다.
6. 주기적으로(~30분마다) 파란색 군체가 나타나는지 확인합니다.
   메모: 약한 미끼: 표적 상호 작용이 긍정적인 파란색 신호를 생성하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다(위양성 결과를 제공할 수 있는 장기간의 배양(>8시간)을 피하십시오). 최상의 결과를 얻으려면 갓 동형전환된 콜로니, 즉 30°C에서 4 - 5일 동안 자란 콜로니, 직경 ~2mm를 사용하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
플레이트 인큐베이터	헤레오스	B6120	장치
오비탈 쉐이커 인큐베이터	뉴브런즈윅 사이언티픽	이노바 4300	장치
분광 광도계	퍼킨 엘머	람다 바이오+	장치
매치메이커 투 하이브리드 시스템 2 키트	타카라 클론텍	K1604-1	미끼 벡터 pGBKT7, 먹이 벡터 pACT2 및 효모 균주 Y190을 포함합니다
효모 질소 염기	시그마-알드리치	Y0626	최소 SD growh 배지를 준비하기 위해
류신과 트립토판이 결핍된 탈락 보충제	시그마-알드리치	Y0750	최소 SD growh 배지를 준비하기 위해
류신, 트립토판, 히스티딘이 부족한 드롭아웃 보충제	시그마-알드리치	2001	최소 SD growh 배지를 준비하기 위해
청어 고환 운반체 DNA	타카라 클론텍	630440	효모 형질전환용
Whatman 여과지 5급	시그마-알드리치	WHA1005070	콜로니 리프트 여과지 β-Gal 분석에 사용
X-Gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드)	시그마-알드리치	나4252	콜로니 리프트 여과지 β-Gal 분석에 사용

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