단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위한 Tandem Affinity Purification Assay

초록

출처: Ma, Z., et al. 진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 친화성 정제. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위해 진핵 세포에서 단백질 복합체를 정제하는 기술인 탠덤 친화성 정제를 보여줍니다. 이 복합체에는 서로 다른 항원결정기 태그로 표지된 두 개의 단백질이 포함되어 있습니다. 두 개의 서로 다른 태그에 대한 친화력을 가진 두 개의 수지를 순차적으로 사용하여 복합체를 정제할 때, 용리액에 두 단백질이 모두 존재하면 둘 사이의 상호 작용을 확인할 수 있습니다.

프로토콜

1. 도금 셀

1. 형질주입 하루 전, 100mm 접시당 10%(v/v) 소태아 혈청(FBS) 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신(10,000U/ml 스톡)이 보충된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium) 10mL에 3.5 x 10⁶ HEK293T 세포를 플레이트화합니다. 플레이트 3 - 5 100 mm 충분한 단백질 회수를 보장하기 위해 실험/조건당²개의 접시.
   메모: 플레이트의 수는 각 실험/조건에 대해 결정되어야 하며, 이는 관심 단백질 복합체의 발현 수준과 용해도에 따라 달라집니다. 또는 더 큰 규모의 정제가 필요한 경우 세포주를 스피너 플라스크의 현탁액에서 성장하도록 조정할 수 있지만 이 방법은 일시적인 transfection에는 작동하지 않습니다.

2. 세포 transfection 또는 안정적인 세포주 유도

1. 다음 날, 현미경으로 세포를 확인하십시오. 진행하기 전에 셀의 70 - 80% 융합도가 있어야 합니다.
2. 100mm 접시당 7μg의 플라스미드 DNA와 21μl의 형질 주입 시약의 총 혼합물로 세포를 형질 주입합니다. GFP를 발현하는 벡터를 가진 세포를 transfection 효율을 위한 control로 사용합니다(표 1).
   메모: 독시사이클린에 대한 반응으로 두 개 이상의 복잡한 소단위체의 발현을 유도하는 HEK293-T-REx 또는 이와 유사한 안정적인 세포주를 사용하는 경우, 유도체를 세포에 첨가하고 48시간 동안 배양해야 합니다. 유사하게, 유도제의 추가에 GFP의 발현을 유도하는 안정된 세포주도 검증 목적을 위해 필요할 것입니다. 2.7단계로 진행합니다.
3. 100mm 접시당 형질주입 혼합물을 준비합니다. 1.5 ml 마이크로 원심분리 튜브에서 500 μl의 비보충 DMEM과 7 μg의 총 플라스미드 DNA(2개 이상의 플라스미드에 해당)를 혼합합니다. 별도의 마이크로 원심분리 튜브에서 500μl의 비보충 DMEM과 21μl의 transfection 시약을 혼합합니다. 각 transfection 반응에 대해 반복합니다.
4. transfection 시약 용액을 plasmid DNA 용액에 피펫팅합니다(용액을 역순으로 혼합하지 마십시오). 최소 4회 피펫팅으로 혼합합니다.
5. 이 혼합물을 실온에서 10 - 15분 동안 배양하되 15분을 넘지 마십시오.
6. 플레이트를 기울여 배지 저장소를 만들고 세포를 방해하지 않고 트랜스펙션 혼합물을 플레이트의 내부 면에 적방울 방향으로 조심스럽게 피펫팅합니다. 접시를 원래의 평평한 위치로 되돌리고 부드럽게 휘젓어 혼합물을 분산시킵니다.
7. 37°C에서 5%_CO2가 함유된 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 배양합니다(이 조건은 이하 "조직 배양 인큐베이터"라고 함). transfection 후 5시간 후에 미디어를 교체합니다(선택 사항).

3. Transfection 또는 Induction Efficiency 점검

1. transfection 후 24시간이 지나면 형광 현미경으로 세포를 시각화하여 transfection 효율(또는 GFP를 발현하는 control HEK293T-REx 안정 세포주 유도)을 확인합니다. 24시간 더 배양합니다.

4. 연쇄상구균 친화성 정제(STREP AP)

1. 세포 수집
   1. transfection 후 48시간이 지나면 배지를 제거하고 차가운 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 8ml를 추가합니다. 플레이트에서 세포를 분리하기 위해 위아래로 피펫팅합니다.
   2. 세포 현탁액을 수집하여 15mL 튜브로 옮기고 4°C에서 4분 동안 800 x g에서 세포를 스핀다운합니다.
   3. PBS 상층액을 제거합니다. 스핀다운(800°C에서 1분 동안 4 x g)을 반복하여 잔류 PBS를 제거합니다. 나중에 사용할 수 있도록 세포 펠렛을 -80°C에서 보관하거나 아래 절차에 따라 단백질 정제를 계속하십시오.
2. 세포 용해
   1. 수동 용해 완충액 (PLB : 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 프로테아제 억제제 칵테일 정제, 5 % v / v 글리세롤 및 1.0 % NP-40)의 ×세포 펠릿 부피 (플레이트 당 ~ 250 μl)를 사용하여 세포 펠릿을 재현 탁액을 1.5 ml 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다.
   2. 현탁액을 짧게 소용돌이치고 4°C에서 30분 동안 nutate
   를 만듭니다.
   3. 셀 현탁액을 10,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 스핀다운합니다.
   4. 용해성 용해물을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 세포 펠릿을 버립니다. 용해성 용해물의 최종 부피의 10%를 "STREP AP Input"으로 저장합니다. 4°C에서 보관하십시오.
3. STREP 비드 평형
   메모: 첫 번째 AP 단계에 연쇄상구균 비드를 사용하십시오! STREP 비드로 끌어내린 복합체는 FLAG 비드로 끌어내린 복합체보다 훨씬 더 많은 단백질을 회수합니다.
   1. 50% STREP 비드 슬러리(n = 샘플 수)를 (n × 40 μl) + n μl로 꺼내고 4 °C에서 2분 동안 1,500 x g로 스핀 다운합니다.
      알림: 입이 넓은 팁을 사용하여 비드를 피펫으로 만듭니다.
   2. 상층액을 제거하고 비드에 PLB 500μl를 추가합니다. 비드 혼합물을 4°C에서 5분 동안 너트화하고 1,500 x g에서 4°C에서 2분 동안 스핀다운합니다.
      1. 총 3회 세탁을 반복합니다. PLB의 비드를 n × 40 μl의 최종 부피로 재현탁합니다.
   3. 각 세포 용해물 샘플에 40μl의 50% STREP 비드 슬러리를 추가하고 4°C에서 2시간 동안 호두화합니다.
4. 연쇄상구균 AP
   1. 용액을 1,500 x g에서 4°C에서 2분 동안 스핀다운합니다.
   2. 상층액을 제거하고 4°C에서 "STREP AP Flow-through (FT)"로 보관하십시오.
   3. 비드에 500μl의 STREP AP 세척 버퍼 I(20mM Tris-HCl pH 7.5, 250mM NaCl, 1.5mM MgCl₂, 1mM DTT, 5% 글리세롤 및 0.2% NP-40)을 추가합니다. 비드 혼합물을 4°C에서 5분 동안 너트화하고 4°C에서 2분 동안 1,500 x g에서 2분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버립니다.
      1. 총 4번의 세척에 대해 반복합니다.
         메모: 네 번째 세척 전에 비드 용액을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 단백질 배경을 줄입니다. 이 단계는 필수적입니다.
   4. 500μl 세척 버퍼 II(100mM Tris-HCl pH 8.0, 150mM NaCl 및 1mM EDTA)를 추가하고 튜브를 반전시켜 비드를 평형화합니다. 1,500 x g에서 4°C에서 2분 동안 스핀다운하고 상층액을 버립니다.
   5. 50μl의 STREP 용리 완충액(100mM Tris-HCl pH 8.0, 150mM NaCl, 1mM EDTA 및 2.5mM Desthiobiotin)으로 관심 단백질을 용리합니다. 800 rpm에서 4 °C에서 15 분 동안 와류.
   6. 1,500 x g에서 4°C에서 1분 동안 비드를 스핀다운합니다.상층액을 수집합니다. 이 분획은 "STREP AP 용리" 샘플에 해당합니다.
   7. 두 번째 용리를 위해 비드 분획을 4°C에서 저장하면 첫 번째 용출로 얻은 단백질 양의 최대 절반을 얻을 수 있습니다. 은 염색 및/또는 웨스턴 블로팅을 위한 STREP AP 용리의 10%를 분취합니다.
5. FLAG 비드 평형 맞추기
   1. FLAG 비드 용액(n x 16 μl) + n μl를 꺼내고(n = 샘플 수) 1,500 x g에서 4°C에서 2분 동안 스핀다운합니다.
      메모: 입이 넓은 팁을 사용하여 비드를 피펫으로 만듭니다.
   2. 상층액을 제거하고 비드에 500μL의 FLAG 세척 버퍼(100mM Tris-HCl pH 8.0, 150mM NaCl, 1mM EDTA 및 0.1% NP-40)를 추가합니다. 1,500 x g에서 4°C에서 2분간 스핀다운합니다. 총 3회 세탁을 반복합니다.
   3. FLAG 세척 버퍼의 비드를 n x 16 μl의 최종 부피로 재현탁합니다.
   4. 16μl의 FLAG 비드 슬러리를 나머지 STREP AP 용리액에 첨가하고 4°C에서 하룻밤 동안 영양 주입합니다.

5. 플래그 IP

1. 4°C에서 2분 동안 1,500 x g에서 FLAG beads 현탁액을 스핀다운합니다. 상등액을 저장하고 4°C에서 "FLAG IP Flow-through"(FT)로 보관합니다.
2. 용액에 500μl의 FLAG 세척 버퍼를 추가합니다. 4°C에서 5분 동안 nutate하고 4°C에서 2분 동안 1,500 x g에서 원심분리합니다.총 4회 세척을 반복하고 각 세척 후 상등액을 제거합니다.
   메모: 네 번째 세척 전에 protein-bead 용액을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 백그라운드를 줄입니다. 이 단계는 필수적입니다.
3. 최종 스핀에서 상등액을 제거하고 200ng/μl의 FLAG 펩타이드가 함유된 30μL의 FLAG 세척 버퍼를 비드에 추가합니다. 4°C에서 2시간 동안 800rpm의 와류.
4. 현탁액을 1,500 x g에서 4°C에서 2분 동안 스핀다운합니다.상층액을 수확하고 4°C에서 "FLAG IP Elution"으로 보관합니다.
   메모: 용리 샘플은 표준 프로토콜을 사용하여 은 염색 및/또는 웨스턴 블롯으로 확인할 수 있으며 추가 단백질 분석을 위해 준비되었습니다. 웨스턴 블롯을 설정할 때 (1) STREP AP 입력, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP 용리, (4) FLAG IP FT 및 (5) FLAG IP 용리를 모두 실행합니다. 로드된 볼륨은 각 실험에 대해 결정해야 합니다. 수집된 모든 샘플과 비드는 단기 보관의 경우 4°C, 장기 보관의 경우 -80°C에서 보관할 수 있습니다. TAP 시료는 질량 분석법으로 분석하여 구성 요소의 정체를 확인하고, 새로운 번역 후 변형(PTM)을 식별하고/하거나 정제된 복합체와의 새로운 단백질 상호 작용을 발견할 수 있습니다. 이를 위해 쿠마시 젤이나 실버 염색제를 사용한 후 깨끗한 메스를 사용하여 젤에서 밴드를 절제할 수 있습니다. 질량 분석 방법에 대해 논의하는 여러 훌륭한 리뷰가 이전에 발표되었습니다.

결과

표 1: 본 연구에서 사용된 플라스미드. CycT1 및 CDK9를 pcDNA/4TO-STREP 및 pcDNA/4TO-FLAG 플라스미드 벡터에 연결하였다. 이러한 구축물은 DH5α 수용 세포로 형질전환되고 LB-암피실린 플레이트에 도금되었습니다. 군체를 선택하고, 성장시키고, 선별했습니다. 성공적으로 결찰된 클론은 Sanger 염기서열분석 및 제한 분해 및 아가로스 겔 전기영동의 조합에 의해 검증되었습니다. CycT1의 경우 마지막 18개의 잔기에는 단백질 분해를 위한 신호 펩타이드 역할을 하는 PEST 서열(프롤린, 글루타민산, 세린 및 트레오닌이 풍부한 펩타이드 서열)이 포함되어 있기 때문에 전체 길이(1 - 726) 대신 더 짧은 버전(1 - 708)을 사용했습니다. CDK9은 전체 길이였습니다. 탠덤 STREP 태그의 순서는 다음과 같습니다: GGGGWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK. 탠덤 FLAG 태그의 순서는 GGGGDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco의 변형 독수리 매체(DMEM)	피셔 사이언티픽	SH30022FS
소 태아 세럼	하이클론	SH30071
페니실린/스트렙토마이신	피셔 사이언티픽	MP091670049
폴리젯	피셔 사이언티픽	50-478-8
프로테아제 억제제 칵테일	로슈	11836153001
STREP-Tactin Superflow	증권 시세	제2-1208-010
STREP-태그 용리 완충액	증권 시세	제2-1000-025
EZview 레드 ANTI-FLAG M2 어피니티 젤	시그마	SLBQ1981V
코닝 100mm × 20mm 스타일 접시 세포 배양 처리 된 비발열 폴리스티렌 20 / 슬리브	코 닝	430167
단백질 Lo-Bind Eppendorf	피셔 사이언티픽	13-698-794
디지털 소용돌이 믹서	피셔 사이언티픽	02-215-370
48홀 마이크로 튜브 폼 랙	피셔 사이언티픽	02-215-386
Labquake 셰이커 로티세리	열	제415110

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