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$$\longrightharp{xx}$$,
본 연구에서는 CV-N 대신 CVN-small ubiquitin-like modifier(SUMO) 융합 단백질이 효소 결합 면역흡착 분석에 사용되었으며 세포 기반 분석에 적합합니다. 재조합 전장 인플루엔자 A 바이러스 HA H3 단백질은 표준 프로토콜에 따라 상업적으로 얻거나(재료 표 참조) 포유류 HEK293 세포주 및 바큘로바이러스에 감염된 곤충 세포에서 발현됩니다. 우한-1 스파이크 단백질은 포유류 HEK293 세포에서 발현됩니다. 몬-만노실화 펩타이드(MM)와 디만노실화 펩타이드(DM)의 합성을 통해 CVN2 및 모노 만노실화 소분자에 대한 균질한 리간드를 검출할 수 있습니다.
1. CV-N 구문 만들기
- 각 CVN2 변이체 및 CVN2L0 단백질(PDB ID 3S3Y)에 대해 상용 소스에서 pET27b(+) 벡터의 N-말단 pelB 리더 서열 및 His-태그를 가진 유전자 구성을 얻습니다(표 1 참조).
- CVN2L0 및 해당 변형(V2, V3, V4 및 V5; 그림 1A,C)를 각 CV-N 반복에 대해 두 개의 별개의 DNA 염기서열로 구성된 CVN2L0 주형 유전자의 배경에 있습니다.
- 동결건조된 플라스미드 DNA를 멸균 탈이온수 증류수(ddH2O)에 최종 농도 100ng/μL까지 용해시킵니다.
2. 플라스미드 DNA 형질전환 세포를 사용한 LB-한천 플레이트의 제조
- 펩톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, NaCl 5g/L를 ddH2O에 용해하여 배양 배지 LB-Lennox를 준비하고(재료 표 참조) pH를 7.4로 조정합니다. 이전에 발표된 보고서에 따라 화학적 방법으로 각 변형체(V2-V5)에 대해 유능한 대장균 BL21(DE3)로 형질전환을 수행합니다.
- 용액(900 μL 및 100 μL)을 분할하고 LB-한천 플레이트(50 μg/mL 카나마이신)에 100 μL를 전달한 다음 멸균 세포 스프레더를 부드럽게 사용합니다. 37 ° C에서 밤새 한천 플레이트를 배양합니다.
3. 복제
- CV-N에 대한 유전자를 pET11a의 NdeI 및 BamHI 부위에 서브클론화(재료 표 참조)하여 전기 역량 세포로의 변환(전기천공법)을 참조합니다.
4. 부위 지시 돌연변이 유발
- 각 CV-N 반복에 대해 두 개의 구별된 DNA 염기서열을 포함하는 CVN2L0 템플릿 유전자의 배경에서 CVN2L0 및 돌연변이 CVN-E41A를 생성합니다.
- PCR을 실행하기 위해 부위 지정 돌연변이 유발 키트(재료 표 참조) 및 특정 돌연변이 유발 프라이머 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' 및 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3'을 사용하여 돌연변이를 만듭니다.
- 5-50 ng 범위의 다중 농도의 이중 가닥 DNA(dsDNA) 템플릿(예: 5, 10, 20 및 50 ng의 dsDNA 템플릿)을 사용하여 일련의 샘플 반응을 시작합니다. 프라이머 농도를 일정하게 유지하십시오.
메모: PCR mix 및 thermal cycling 프로토콜은 일반적으로 site-directed mutagenesis kit의 사용 설명서에 설명된 대로 사용됩니다.
- 미네랄 오일 오버레이 아래에 DpnI 제한 효소(1 μL, 10 U/μL, 재료 표 참조)를 추가합니다. 반응을 철저하고 부드럽게 혼합하고, 탁상용 마이크로 원심분리기에서 1분 동안 스핀다운한 다음, 부모 슈퍼코일드 dsDNA를 소화하기 위해 37°C에서 1시간 동안 즉시 배양합니다.
5. 세균 세포의 형질전환
- XL1-Blue 슈퍼 컴피턴트 셀(재료 표 참조)을 얼음 위에서 부드럽게 해동합니다. 각 대조군 및 샘플 반응을 변형시키기 위해 매우 유능한 세포(50 μL)를 사전 냉각된 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브(14 mL)로 분취합니다.
- 각 대조군 및 샘플 반응(돌연변이된 ssDNA)에서 1 μL의 Dpn I-처리된 단일 가닥 DNA(ssDNA)를 상보적 가닥을 합성하는 초유능 세포의 별도 부분 표본으로 전달합니다. 변형 반응을 조심스럽게 소용돌이쳐 30분 동안 얼음 위에서 반응을 혼합하고 배양합니다.
메모: Dpn I-처리된 DNA를 형질전환 반응으로 옮기기 전에 피펫 팁에 남아 있는 미네랄 오일을 조심스럽게 제거하는 것이 좋습니다. 선택적 대조군으로, 0.1 ng/μL의 pUC18 대조 플라스미드(1 μL)와 50 μL의 초역량 세포를 혼합하여 XL1-Blue 초역량 세포의 형질전환 효율을 확인해야 합니다.
- 42°C에서 45초 동안 변형 반응에 열 펄스를 가한 다음 반응을 얼음 위에 2분 동안 놓습니다.
메모: 적용된 열 펄스는 이미 폴리프로필렌 원형 튜브(14mL)에서 언급된 조건에 맞게 최적화되었습니다.
- NZY+ 육수 0.5mL(1리터당 함유: NZ 아민(카제인 가수분해물) 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g, 1M MgCl2 12.5mL, 1M MgSO4 12.5mL, 2M 포도당 10mL, pH 7.5, 42°C로 예열)을 추가하고 37°C에서 225-250rpm으로 1시간 동안 진탕하면서 형질전환 반응을 배양합니다. LB-암피실린 한천 플레이트에서 각 형질전환 반응(대조군 플라스미드 형질전환으로 5μL, 샘플 형질전환에서 250μL).
메모: 형질전환 제어 및 돌연변이 유발을 위해 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside(X-gal, 80μg/mL) 및 isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside(IPTG, 20mM)를 갖는 LB-ampicillin 한천 플레이트에 세포를 퍼뜨립니다(재료 표 참조). 분석을 위해 돌연변이된 플라스미드 DNA를 정제하기 위해 형질전환된 대장균 세포의 단일 콜로니로 세포 배양 50mL를 접종합니다. 돌연변이 유발은 외부 시설에서 DNA 염기서열분석을 통해 확인됩니다.
6. 발현 및 단백질 정제
- 대규모 배양의 경우, 형질전환된 플레이트에서 단일 콜로니로 소량의 LB(암피실린 함유)를 접종합니다.
- 하룻밤 배양을 사용하여 발현 배양액에 MgCl2 10mM, MgSO4 10mM, 포도당 20mM과 같은 첨가제를 접종하고 종자 배양을 1/100로 희석합니다.
- 37°C에서 격렬하게 흔들면서 세포를 성장시킵니다. 세포를 20°C로 냉각하기 전에 0.4-0.6(중간 로그 단계) 사이의 Abs 600nm로 세포를 성장시킵니다. 1mM IPTG로 유도하고 밤새 성장합니다.
- 그런 다음 4,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리하여 세포를 수확하고 피펫으로 상층액을 폐기합니다.
- 세포 펠릿을 인산염 완충 식염수(PBS) 완충액에 재현탁하고 4°C에서 15분 동안 4,000 x g에서 재원심분리합니다. 그런 다음 피펫으로 상등액을 버립니다. 남은 펠릿을 10mL의 용해 완충액에 재현탁시키고 37°C에서 1시간 동안 현탁액을 배양합니다.
메모: 용해 완충액의 조성 : (NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, 2 % Triton-X 100, 라이소자임 500 ng / mL, 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF) 1 mM, 디티 오 트레이톨 1 mM, MgCl2 1 mM, pH 8, 재료 표 참조).
- 혼합물에 두 번의 동결-해동 주기(-80°C)를 적용합니다. 4°C에서 15분 동안 4,000 x g에서 원심분리하여 용해성 및 불용성 분획을 분리하고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE), 특히 도데실황산나트륨(SDS)-PAGE(그림 1B, C)를 사용하여 분석합니다(그림 1B, C).
메모: 세포는 동결-해동, 초음파 처리, 균질화, 효소 용해 또는 이러한 방법의 조합과 같은 여러 가지 방법으로 용해될 수 있습니다. 봉입체(inclusion body)로부터의 정제는 높은 단백질 수율을 수집하기 위해 권장됩니다.
- Ni-NTA 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정제합니다(재료 표 참조). 용해성 분획을 재생된 Ni-NTA 비드 컬럼(1mL/분)에 로드합니다. 그래디언트(60분 동안 TBS에서 0-100% 500mM 이미다졸)를 시작하고 분획(1mL/분)을 수집하기 전에 TBS 버퍼(50mM Tris, 150mM 염화나트륨, pH 7.5)로 시스템을 세척합니다. 100mM PBS에 대한 생화학적 특성 분석을 위해 정제된 단백질을 투석합니다(그림 1C, D).
- 또는 14mL 튜브에 His-Select Ni2+ 친화성 겔(재료 표 참조)을 사용하여 각각 20mM 이미다졸 및 250mM 이미다졸이 함유된 완충 용액에서 His-tagged 재조합 발현 CV-N을 결합하고 다시 현탁합니다. 최소 30분 동안 일괄적으로 배양합니다.
메모: 이러한 반정제 단백질을 일회용 사전 패킹 컬럼에 적용하여 고정된 금속 친화성 크로마토그래피에서 1-1.5mL 용리액을 로드할 수 있는 탄수화물 및 단백질과 같은 생물학적 샘플의 완충액 교환 및 클린업을 수행합니다.
- 단백질 용액을 10kDa 차단 필터(재료 표 참조)가 있는 원심분리 튜브로 옮기고 4,500 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 농축합니다. SPR 측정의 경우 분석물 용액을 10mM HEPES, 150mM 염화나트륨, 3mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 0.05% Tween20, pH 7.4(HBS-EP(+), 재료 표 참조)로 교체합니다.
- 이 SPR 러닝 버퍼를 1:10의 희석 계수에 추가하고 4,500 x g 및 4°C에서 10분 동안 초기 부피에 4회 원심분리합니다.
- 23,474Da의 크기를 보여주는 주요 단백질 CVN2L0에 대해 계산된 흡광 계수(20,440 M-1 cm-1)를 기반으로 NanoDrop UV-Vis 분광 광도계(재료 표 참조)를 사용하여 280 nm에서 단백질 농도를 측정합니다. PBS(100 mM, pH 7.0) 또는 SPR 버퍼를 블랭크로 사용하고 세 가지 희석 단계(1:1, 1:10 및 1:100).
7. SPR 분광법
- 재생 버퍼로 HBS-EP(+) 및 10mM 글리신 HCl pH 1.5-1.6을 실행하는 이중 채널 SPR 시스템(재료 표 참조)을 사용합니다. 기기, 탈기 장치, 자동 샘플러 및 펌프를 켜고 전체 시스템을 ddH20으로 1시간 동안 세척합니다. 바로 사용할 수 있는 러닝 버퍼를 별도의 병에 넣습니다.
- 이멀젼 오일을 검출기에 떨어뜨리고 얇은 금 필름으로 코팅되고 카르복시메틸 덱스트란 하이드로겔로 기능화된 상부의 유리 센서 칩(재료 표 참조)을 3포트 플로우 셀 아래의 검출기에 직접 장착합니다. handling.
를 아래로 당겨 설정을 수정합니다.
메모: C19RBDHC30M 200nm 스트렙타비딘 유도체화된 카르복시메틸 덱스트란 하이드로겔은 중간 밀도의 비오틴화된 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스-2 RBD 단백질을 함유하고 있으며, 사전 고정 리간드가 있는 즉시 사용 가능한 센서 칩입니다.
8. HA, S 단백질 및 RBD에 대한 CV-N 결합을 위한 SPR 결합 분석
- 아래 단계에 따라 proteinaceous ligands를 센서 칩에 고정시킵니다.
- 메뉴 표시줄에서 양식을 클릭하고 통합 SPRAutoLink 소프트웨어에서 Run Table Editor를 클릭하여 실행 테이블을 엽니다(재료 표 참조). 사용 가능한 실행 테이블 목록에서 BASIC_Immobilization 선택하고 클릭하고 컴퓨터 화면에서 실험 절차의 단계를 따릅니다. 사용된 각 샘플 편집기는 오른쪽 상단 모서리에 표시됩니다.
- Form 섹션에서 Sample Set Editor를 클릭하여 추가 분석을 위해 자동 시료 주입기에 배치된 두 개의 랙에 대한 시약 목록을 작성합니다. 메뉴 표시줄에서 Autosampler Direct Control을 "Tool"로 클릭하여 랙을 앞뒤로 가져옵니다. 작동 온도로 4°C를 선택합니다.
메모: SPR 소프트웨어는 해당 도구를 선택하고 자동 시료 주입기 처리를 선택하고 양식을 클릭하여 "SPR 기기 직접 제어" 및 "펌프 직접 제어"를 허용합니다. 또한 Run Table Editor, Data-Plot 또는 Post-Processing을 선택하여 데이터 분석을 수행할 수 있습니다. 파일은 기본 디렉토리에 직접 저장되고 포스트 프로세싱 창에서 scrubber.files로 내보내집니다.
- Tools 및 Pump Direct Control을 클릭하여 ddH20을 주입하도록 펌프를 시작하고 SPR Instrument Direct Control을 클릭하여 데이터를 기록하고 새로 나타나는 창에서 매번 시작을 클릭합니다. 커플링 시약(단계 8.3)을 300μL 바이알에 넣고 자동 시료 주입기 랙에 넣은 다음 Run.
를 클릭하여 실행 테이블을 시작합니다.
메모: 칩 표면은 10mM 글리신 완충액 pH 9.0으로 컨디셔닝되거나 1M 염화나트륨, 0.1M 붕산나트륨 버퍼, pH 9.0으로 플러시되어 EDC/NHS 활성화 혼합물을 위한 카르복실 유도체화된 칩 표면을 컨디셔닝할 수 있습니다.
- 이 간단한 단백질-단백질 상호 작용을 위해 CMD500D 칩(재료 표 참조)을 사용하여 고정화된 HA가 있는 미세 굴절률 단위(μRIU) = 2500 - 3000 플로우 셀과 스파이크 단백질이 있는 μRIU = 400 플로우 셀을 생성합니다. 15μL/min의 주입 유속으로 다음 순차적 단계를 적용하여 0.4M N-에틸-N'-(디메틸아미노 프로필) 카르보디이미드 염산염(EDC*HCl) 및 0.1M N-하이드록시숙신이미드(NHS)의 수성 및 동일한 혼합물을 주입합니다.
- 25,000μL/분으로 리필 펌프를 리필하고, 30초 동안 베이스라인 조정을 수행하고, 6분 접촉 시간 동안 90μL의 샘플 활성화 용액(EDC/NHS)을 주입한 다음 다시 5분 동안 유지합니다.
- 왼쪽 플로우 셀(파란색)에서만 10μL/분으로 1분 동안 기준선을 실행하여 화학적으로 합성된 펩타이드, HA 및 스파이크 단백질을 20μg/mL로 주입 및 고정하고 활성화된 칩 표면을 1M 에탄올아민 HCl pH 8.5로 담금질하기 전에 1.5분 동안 ddH2O로 후속 기준선 조정을 허용합니다.
- 액체 샘플러에서 탈기 장치로 튜브를 ddH20에서 HBS-EP(+)가 있는 병으로 전환합니다(그림 2).
- SPR 센서그램을 분석합니다.
- kinetic 연구를 수행하려면 다양한 분석물 농도(10-5-10-8 M)를 사용하며, 각 주입 후 재생 단계를 수행하고 다른 분석물을 주입한 후 블랭크 측정을 수행합니다. 유속을 10μL/min으로 변경하고 접촉 시간 4분 동안 주입을 시작한 다음 5분 베이스라인 생성과 30초 간격으로 각각 2분씩 두 번의 재생 단계를 시작합니다.
- 블랭크 측정을 위해 버퍼 용액을 주입하며, 이 용액의 센서그램은 다양한 단백질 농도를 정규화하기 위해 시료 실행에서 차감됩니다.
- 양식을 클릭하고 아래로 스크롤한 다음 이 작업 모드를 클릭하여 "후처리"로 변경합니다. Add(추가)를 클릭하여 각 플로우 셀에 대한 Data Plot Form(데이터 플롯 양식)에서 시간이 지남에 따라 생성된 바인딩 곡선을 선택하고 오버레이를 스크러버 파일(.ovr)로 내보냅니다. 파일을 클릭하여 파일 저장 옵션을 엽니다. 왼쪽 곡선과 오른쪽 곡선을 정렬하고 리간드 채널의 신호에서 두 번째 참조 채널의 신호를 빼서 응답 곡선을 구합니다.
메모: 데이터는 센서그램을 계산적으로 정의하여 "후처리"에서 작동합니다. 왼쪽 및 오른쪽 플로우 셀의 센서그램 오버레이에 넣거나 두 채널의 차이에서 센서그램으로 표시됩니다.
- 결합 측정 전후에 50-100mM 글리신 완충액 pH 9.5, 물 및 20% 에탄올로 전체 유체를 세척하여 0.5% SDS 및 글리신으로 미량의 염 또는 단백질 오염을 제거하거나 더 엄격하게 제거합니다.
메모: 기기 손상을 방지하려면 칩이 버퍼 아래 또는 100% 습도에서 보관된 경우 칩 카트리지를 기기에 다시 삽입하기 전에 유리 칩의 기계적 안정성을 확인하는 것이 좋습니다.
표 1: Langmuir 1:1 결합 모델을 사용하여 CVN2L0 및 Cys-Cys 결합 변형체 V2, V4 및 V5를 HA에 결합하기 위해 SPR 센서그램에서 얻은 운동 데이터. KD [M] = k꺼짐/k켜짐 또는 kd/ka. 모든 데이터는 HBS-EP(+) 버퍼에서 25°C에서 생성됩니다.
화
화
화
화
| 분석물 | k에 [M-1*s-1] | K오프 [S-1] | 케이디 |
| CVN2L0 | 5.1 3 | 1.3 E-3 | 255nM |
| V2 | 4.0 3 | 1.1 E-3 | 275 nM |
| V4 | 1.2 3 | 1.3 E-3 | 11 μM의 |
| V5 | 1.2 3 | 5.8 이-2 | 5 μM |
