원자 수준의 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 핵 자기 공명

초록

출처: Winkelaar, G., et al. 핵 자기 공명 분광법(NMR) 및 마이크로 열영동(MST)에 의한 구형 단백질과 필라멘트 단백질의 상호 작용 측정. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 ¹⁵개의 N-표지된 야생형 및 돌연변이 엔보플라킨 단백질과 표지되지 않은 비멘틴 단백질 사이의 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 핵 자기 공명 분광법 기술에 대해 설명합니다. 야생형 엔보플라킨과 비멘틴 사이의 성공적인 상호 작용은 NMR 스펙트럼에서 광범위한 라인 확장과 피크 소멸로 이어지는 반면, 돌연변이된 엔보플라킨과 비멘틴 사이의 상호 작용이 없으면 NMR 스펙트럼에서 잘 분리된 피크를 초래합니다.

프로토콜

1. NMR 방법

1. NMR 샘플 준비
   1. 15 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 20을 사용하여 1914 N 표지 야생형 또는 R7E E-PRD 단백질을 정제합니다. 단백질 스톡 용액은 일반적으로 0.3 - 1mM 범위이며 부피는 약 1mL.
      입니다. 메모: MWCO 3 kDa, 5 mL 원심 한외여과 장치를 사용하여 단백질을 >100 μM까지 농축하여 시료 준비에 적합한 범위로 농도를 높일 수 있습니다.
   2. 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7을 사용하여 라벨링되지 않은 VimRod 단백질 샘플을 정제합니다.
   3. 500 μL의 최종 부피에서 야생형 또는 돌연변이 E-PRD 단백질을 100μM의 최종 농도로, 중수소 산화물 (D₂O)을 10 % (v / v)의 최종 농도로, DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid)를 20 μM의 최종 농도로 추가합니다.20 mM Tris-HCl을 사용하여 샘플 부피를 최대 500 μL로 가져옵니다. 1mM DTT 및 pH 7. 대표적인 시료 준비는 표 1.
      에 설명되어 있습니다. 메모: DSS의 0ppm 공진은 ^1H화학적 이동을 보정하고 단백질의 ^15N화학적 이동을 간접적으로 참조하는 데 사용됩니다. D₂O 는 분광계가 일정한 순 자기장에서 작동하도록 유지하기 위해 중수소 잠금 신호에 사용됩니다.
   4. 이전 단계에서와 같이 E-PRD,_D2O및 DSS의 두 번째 샘플을 구성하고 부피를 500μL까지 올리기 전에 VimRod를 최종 농도 50μM에 추가합니다.
   5. 실험을 위해 500μL 샘플을 5mm 너비의 NMR 튜브로 옮깁니다.

2. NMR 실험 설정

1. eject 명령 "ej"로 공기 흐름을 켜십시오.amp자석에서 위로 올라갑니다. 이제 개구부 옆의 자석 위에 있는 스피너 내에 샘플을 놓고 "ij" 명령으로 삽입합니다. 계속하기 전에 샘플이 자석 내부에 가라앉을 때까지 기다리십시오.
2. "edc" 명령을 사용하여 새 데이터 세트를 생성하고 실험 "ZGPR"을 선택하여 표준 ^1HNMR 매개변수를 로드합니다(그림 1). NAME, EXPNO(실험 번호) 및 PROCNO(처리된 데이터 폴더 번호) 필드를 입력합니다. "Set solvent" 필드에서 용매를 선택하고 "Execute 'getprosol'"을 클릭하여 표준 프로브 헤드 및 용매 종속(prosol) 파라미터를 읽습니다.
3. "lock" 명령을 사용하여 샘플을 중수소화 용매, 즉 D₂O에 잠그고 스윕이 완료되어 잠금에 도달할 때까지 기다립니다.
4. 자동 튜닝 명령 "atma"를 사용하여 샘플을 조정하여 자석의 공진 주파수를 수정하십시오. 자동 튜닝이 완료될 때까지 흔들림 곡선을 모니터링합니다.
5. TOPSHIM("topshim" 명령)을 사용하여 자기장을 시움직입니다. 시밍(Shimming)은 시료 주위의 균일성을 달성하기 위해 자기장을 조정하는 과정입니다. "wsh" 명령을 사용하여 shim 값을 저장하고 동일하거나 유사한 샘플을 사용하는 경우 topshim 전에 "rsh"를 사용하여 읽는 것이 좋습니다.
6. 최대 신호 대 잡음비를 달성하기 위해 "rga" 명령으로 수신기 게인을 조정하십시오.
7. 스펙트럼의 중심을 물 공명 오프셋(o1)에 놓고 "calibo90p1"을 사용하여 1도 양성자 펄스(p1)를 고출력으로 설정합니다.
8. zero go "zg" 명령을 사용하여 양성자 스펙트럼을 수집하고 지수 곱셈("em"), 라인 확장을 포함하는 자유 유도 감쇠(FID), FID의 "ft" 푸리에 변환 및 위상 보정을 적용하기 위한 "pk"를 포함하는 "efp"로 처리합니다.
9. polynomial without integration 옵션을 사용하여 자동 위상 보정 "apk"와 자동 기준선 보정 "absn"을 적용합니다.
10. 실험에서 "SFHMQC3GPPH"를 선택하여 SOFAST HMQC 실험에 대한 새 데이터 세트(1.2.2와 같이)를 만듭니다.
11. proton spectrum에서 최적화된 P1 및 O1을 복사하고 "getprosol 1H p1 plw1" 명령을 사용하여 P1 종속 펄스를 채웁니다. 여기서 p1은 최적화된 P1 값이고 plw1은 P1의 전력 수준입니다.
12. CNST54 상수를 최적화하여 아미드 화학적 이동에 대한 오프셋을 설정하고, CNST55를 최적화하여 관심 스펙트럼 영역을 포괄하기 위해 대역폭을 정의함으로써 수신기 이득을 최적화할 수 있습니다(그림 2). 이러한 파라미터를 선택하려면 2차원 스펙트럼에서 첫 번째 FID(자유 유도 감쇠)를 추출하고 관찰된 신호를 찾아 이를 정의합니다. 또한 이완 지연(D1), 스캔 횟수(NS) 및 더미 스캔(DS)을 변경하여 "gs" 명령으로 허용 가능한 신호 감도를 얻을 수 있으며, 이를 통해 go 및 scan이 실시간으로 데이터 품질을 모니터링할 수 있습니다.
13. Zero Go "zg"를 사용하여 스펙트럼을 기록합니다.

표 1. NMR 샘플 준비.

의 의 의 명 명 의 의 의 명 명

견본	버퍼 A의 1mM E-PRD(ΜL)	버퍼 A의 1mM VimRod1 (μL)	버퍼 A(μL)	D2O에서 200μM DSS(μL)	버퍼 B2 (μL)	총 부피(μL)
E-PRD 단독	50	0	50	50	350	500
E-PRD + 빔로드	50	50	0	50	350	500
1버퍼 A: 20mM Tris-HCl, 1mM DTT, pH 7
2버퍼 B: 23mM Tris-HCl, 1.14mM DTT, pH 7

결과

그림 1: NMR 실험 설정의 화면 캡처. 표시된 창은 HSQC 데이터 세트를 수집하기 위한 표준 실험을 설정하는 데 사용됩니다. 실험 매개변수는 Experiment에 인접하여 읽습니다. 표시된 ZGPR 실험은 표준 및 용매 의존성 양성자 매개변수를 로드하기 위한 초기 실험으로 선택됩니다. 제목 창은 기록 보관을 위해 실험 세부 정보를 입력하는 데 사용됩니다. HSQC 스펙트럼을 수집하기 위해 ZGPR 실험을 SFHMQC3GPPH로 대체합니다.

그림 2: NMR 실험 매개변수 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화 암모늄 (15N, 99 %)	케임브리지 동위원소 연구소	NLM-467	NMR에 대한 동위원소 라벨링
D2O, 중수소 산화물 (D, 99.8%)	케임브리지 동위원소 연구소	DLM-2259	NMR 샘플 준비
DSS, 나트륨 2,2-디메틸-2-실라펜탄-5-설포네이트-D6 (D,98%)	케임브리지 동위원소 연구소	DLM-8206	NMR에 대한 참조
정밀 5mm NMR 튜브, 7인치 길이	SJM/듀터로튜브	보로에코-5-7	NMR 튜브
NMR 분광계(14.1 Tesla)	브루커		NMR 데이터 수집
TCI 5mm z-PFG 극저온 프로브	브루커		NMR 데이터 수집
소프트웨어
브루커 탑스핀 4.0.1	브루커		NMR 데이터 처리

【무수정유출】