Phage Display를 사용하여 타겟 단백질에 대한 친화도가 높은 단백질 선택

초록

출처: Zhang, W., et al., Phage Display를 사용하여 E3 리가가스용 유비퀴틴 변형 변조기 개발. J. Vis. 특급 (2021년)

이 비디오에서는 표적 단백질에 대한 친화도가 높은 단백질을 발현하는 사전 엔지니어링된 파지를 분리하는 파지 디스플레이 기술을 보여줍니다.

프로토콜

1. 파지 라이브러리 준비

1. 파지 라이브러리를 얼음 위에서 해동하고 PBS의 라이브러리 다양성을 100배로 희석합니다. 예를 들어, 라이브러리 다이버시티가 1 x 10¹⁰이고 라이브러리 농도가 1 x 10¹³인 경우 농도가 1 x 10¹²가 되도록 라이브러리를 희석합니다. 여기에 사용된 라이브러리의 경우, 라이브러리 1mL와 PBS 9mL를 결합하여 PBS에서 10배 희석합니다.
   메모: 도서관의 다양성은 도서관을 만드는 동안 결정되었어야 하며, 그렇지 않으면 쉽게 평가할 수 없다. 라이브러리 농도는 mid-log 단계(OD600 0.6 - 0.8)에 E. coli 세포를 접종하고 LB/탄수화물에 도금하여 측정할 수 있습니다.
2. PEG/NaCl 1/5부피를 추가합니다. 예를 들어, 이전에 희석된 라이브러리 10mL의 경우 2mL의 PEG/NaCl을 추가합니다.
3. 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
4. 11,000 x g에서 4°C에서 30분 동안 원심분리기, 상층액을 버리고 2분 동안 다시 원심분리하여 남은 상층액을 끌어내립니다.
   메모: 펠릿을 같은 위치에 유지하기 위해 첫 번째와 두 번째로 같은 방향으로 로터에 튜브를 넣으십시오., 따라서 더 쉽게 볼 수 있도록.
5. 단백질당 1mL의 PBT에 파지 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 4개 단백질의 경우 4mL의 PBT.
   에 펠릿을 재현탁합니다. 메모: 펠릿을 만지지 말고 기포를 유입시키지 마십시오.

2. 타겟 단백질에 파지 표시

1. 선택적 대조군: 100 μL의 파지 라이브러리를 대조 플레이트의 코팅된 각 웰에 추가합니다. 300rpm 궤도 쉐이킹으로 1시간 동안 실온(~20-25°C)에서 배양하고 라이브러리를 제어판에서 타겟 플레이트로 옮깁니다.
2. 타겟 플레이트에서 PB 버퍼를 제거하고 코팅된 각 웰에 100μL의 파지 라이브러리를 추가합니다.
3. 실온(~20-25 °C)에서 300rpm 궤도 쉐이킹으로 1시간 동안 배양합니다.

3. 1라운드 파지 용리

1. 파지 라이브러리를 제거하고 코팅된 웰을 PT 버퍼로 4회 세척합니다. 접시를 뒤집고 종이 타월을 두드려 마지막 방울을 제거합니다.
   메모: 여러 표적 단백질이 하나의 플레이트에 코팅되어 있는 경우 웰 사이의 모든 후속 용액의 흐름을 최소화하십시오.
2. 코팅된 각 웰에 100μL의 0.1M HCl을 추가하고 300rpm 궤도 쉐이킹으로 실온에서 5분 동안 배양합니다.
3. 코팅된 각 웰에 12.5μL의 1M Tris-HCl(pH 11)을 추가하여 pH를 중화합니다.
4. 8개의 웰 모두에서 용리된 파지를 단일 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 풀링합니다. 이송하는 동안 피펫을 위아래로 움직여 용액을 균일하게 만들고 웰의 모든 액체를 흡인합니다.
5. 풀링된 용리된 파지에 10% BSA를 첨가하여 최종 농도 1%를 달성합니다. 950 μL의 일반적인 round one 용리 부피의 경우 95 μL의 10% BSA를 첨가합니다. 4 °C에서 보관하십시오. 이것은 라운드 1 출력입니다.

4. 차기 선발 준비

1. 1.1단계와 같이 다음 선택 라운드를 위해 파지 투입을 배양하기 위한 종자 배양을 준비합니다.
2. 1.2단계에서와 같이 세 번째 선택 라운드를 위해 아래에 언급된 변경 사항으로 플레이트를 코팅합니다.
   1. 96웰 결합 플레이트에 단백질당 4웰만 코팅합니다. 적절한 라운드에 "round 2/3" 또는 "round 4/5" 튜브 내용물의 절반을 사용하십시오. 단백질이 용액에서 침전되는 것을 방지하기 위해 필요에 따라 이러한 튜브의 내용물을 희석하십시오.
3. 다음 선택 라운드를 위해 파지 입력을 준비합니다.
   1. round one output의 절반을 사용하여 3mL의 mid-log phase cells를 접종합니다. 일반적인 1라운드 출력의 경우 500μL의 출력을 접종합니다.
   2. 37°C에서 200rpm 궤도 쉐이킹으로 30분 동안 배양합니다.
   3. M13K07 헬퍼 파지를 1 x 10¹⁰ PFU/mL의 최종 농도에 첨가합니다.
   4. 37°C에서 200rpm 오비탈 쉐이킹으로 1시간 동안 배양합니다.
   5. 전체 3mL 배양액을 30mL의 2YT/탄수화물/칸으로 옮깁니다. 37°C에서 200rpm 궤도 쉐이킹으로 밤새 성장합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Axygen 미니 튜브 시스템(0.65mL, 멸균, 96/랙, 10랙/팩)	피셔 사이언티픽	Tel.: 14-222-198	플라스틱 도자기
BD Difco 탈수 배양 매체 : LB 육수, 밀러 (Luria-Bertani)	피셔 사이언티픽	DF0446-17-3	적정을 위한 플레이트 준비
소 혈청 알부민(BSA), 분획 V	BioShop 캐나다	알b001	버퍼 구성 요소
카르베니실린 디소듐 염 89.0-100.5% 무수	밀리포어-시그마	C1389-5G	파지미드에 감염된 세포 배양
소형 디지털 마이크로플레이트 셰이커	피셔 사이언티픽	11-676-337	장치
코닝 Microplate 알루미늄 밀봉 테이프	피셔 사이언티픽	전화: 07-200-684	밀봉 파지 글리세롤 스톡
탈수 한천	피셔 사이언티픽	DF0140-01-0	적정을 위한 플레이트 준비
DS-11 분광 광도계/형광측정기	드노빅스	DS-11 FX+	장치
Greiner Bio-One CellStar 96-well, 비처리, U자형 바닥 마이크로플레이트	피셔 사이언티픽	7000133	플라스틱 도자기
염산	피셔 사이언티픽	A144-500	화학
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R 화학적으로 컴피턴트 대장	피셔 사이언티픽	C854003	파지 감염을 위한 박테리아 균주
카나마이신 설페이트	피셔 사이언티픽	AAJ1792406	M13K07 헬퍼 파지 감염 세포 배양
M13KO7 헬퍼 파지	뉴잉글랜드 바이오랩스	N0315S	phagemid 패킹과 분비를 허용하십시오
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인산염 완충 식염수(PBS) 10X 용액	피셔 사이언티픽	BP3994	완충액 성분/파지 재현탁액
ELISA 및 배양을 위한 폴리에스테르 필름	폭스바겐	60941-120	배양 중 마이크로플레이트를 덮는 것
폴리에틸렌 글리콜 8000 (PEG)	피셔 사이언티픽	BP233-1	파지 침전
소금	밀리포어-시그마	S3014	파지 침전
멸균 플라스틱 배양 튜브: 반투명 폴리프로필렌	피셔 사이언티픽	14-956-1일	파지 입력 배양
테트라사이클린 염산염	피셔 사이언티픽	BP912-100	대장균 OmniMax 세포 배양
트리스 베이스	피셔 사이언티픽	BP1525	중화 용출된 파지 용액
트립톤 파우더	피셔 사이언티픽	BP1421-2	세포 성장 배지 구성 요소
트윈 20	피셔 사이언티픽	BP337500	버퍼 구성 요소
효모 추출물	피셔 사이언티픽	BP1422-2	세포 성장 배지 구성 요소