단백질 호모올리고머화(Homo-Oligomerization)를 연구하기 위한 형광 변동 분광법(Fluorescence Fluctuation Spectroscopy)

초록

출처: Nolan, R., et al. 보정이 필요 없는 체외 상용 기기 및 무료 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용한 단백질 호모 올리고머화의 정량화. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 단백질 호모올리고머화를 연구하기 위한 형광 변동 분광법(FFS) 기술을 보여줍니다. 샘플의 형광 표지된 단백질은 FFS를 사용하여 단백질 올리고머화를 연구할 때 에이전트를 사용하여 이합체화됩니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 단백질이 작은 관찰 부피 안팎으로 이동할 때 단백질의 올리고머 상태를 결정하기 위해 형광 분자의 밝기 변동 분석을 수행합니다.

프로토콜

1. FKBP12 F36V -mVenus 정화

1. 단량체화된 인간 FKBP12F36V12체와 N-말단 His6 및 mVenus 태그를 포함하는 pET22b 벡터로 (DE3) pLysS 세포를 변환합니다(요청 시 벡터 사용 가능). 50 μg/mL 암피실린과 34 μg/mL 클로람페니콜이 보충된 LB 한천에 플레이트셀.
2. 형질전환된 콜로니를 100 mL LB 스타터 배양으로 옮기고 진탕하면서 37 °C에서 16 - 20시간 동안 성장합니다.
3. 조밀한 스타터 배양물(OD600 >1)을 LB 배지(2 x 500 mL 배치)에 1:100으로 희석하고 OD600 = 0.6 - 0.8 (37 °C, 200 rpm)까지 2 - 3시간 동안 성장합니다.
4. 얼음 위에서 즐기는 시원한 문화. 250 μM IPTG로 유도하고 21 °C, 200 rpm에서 16 - 20 시간 동안 성장합니다.
5. 2,000 x g에서 20분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다.
6. EDTA-free 프로테아제 억제제(세포 펠릿당 1정)가 보충된 IMAC 버퍼 A(20mM sodium phosphate pH 7.5, 500mM NaCl, 3mM 이미다졸, 1mM β-메르캅토에탄올) 40mL에 펠렛을 재현탁합니....

결과

그림 1. 용액에서 단백질 단량체-이량체 전이를 감지하기 위한 N&B의 적용. (a) 레이저 소스(mVenus 표지 단백질의 경우 514nm로 설정)가 장착된 레이저 스캐닝 현미경(LSM)의 단순화된 광학 경로(파란색 화살표)를 FKBP12F36V-mVenus 용액의 100nM 용액을 비추는 침지 대물렌즈(이 경우 63X1.4NA 오일)로 향합니다. 방출 형광(녹색 화살표)은 이색성 거울을 통과하여 방출광을 청소하는 대역통과 필터와 광자 계수가 가능한 포인트 디지털 검출기 바로 앞에 위치한 1 Airy 장치에 설정된 핀홀을 향합니다. (b) 16 x 16 픽셀을 통해 컨포칼 부피의 조명을 스캔하여 가우스 모양의 공초점 부피에 들어오고 나가는 단일 FKBP12F36V-mVenus 분자.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RosettaTM (DE3) pLysS 세포	노바젠	70956-3
암피실린	시그마 알드리치	PubChem 물질 ID 329824407
클로람페니콜	시그마 알드리치	PubChem 물질 ID: 24892250
LB 스타터 문화	키아젠
LB 미디엄	키아젠	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif
증권 시세	시그마 알드리치	PubChem 물질 ID 329815691
IMAC 버퍼	메디카고	09-1010-10
EDTA-free 프로테아제 억제제	시그마 알드리치	11873580001
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