단백질 호모올리고머화(Homo-Oligomerization)를 연구하기 위한 형광 변동 분광법(Fluorescence Fluctuation Spectroscopy)

1. FKBP12 F36V -mVenus 정화

1. 단량체화된 인간 FKBP12F36V12체와 N-말단 His6 및 mVenus 태그를 포함하는 pET22b 벡터로 (DE3) pLysS 세포를 변환합니다(요청 시 벡터 사용 가능). 50 μg/mL 암피실린과 34 μg/mL 클로람페니콜이 보충된 LB 한천에 플레이트셀.
2. 형질전환된 콜로니를 100 mL LB 스타터 배양으로 옮기고 진탕하면서 37 °C에서 16 - 20시간 동안 성장합니다.
3. 조밀한 스타터 배양물(OD600 >1)을 LB 배지(2 x 500 mL 배치)에 1:100으로 희석하고 OD600 = 0.6 - 0.8 (37 °C, 200 rpm)까지 2 - 3시간 동안 성장합니다.
4. 얼음 위에서 즐기는 시원한 문화. 250 μM IPTG로 유도하고 21 °C, 200 rpm에서 16 - 20 시간 동안 성장합니다.
5. 2,000 x g에서 20분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다.
6. EDTA-free 프로테아제 억제제(세포 펠릿당 1정)가 보충된 IMAC 버퍼 A(20mM sodium phosphate pH 7.5, 500mM NaCl, 3mM 이미다졸, 1mM β-메르캅토에탄올) 40mL에 펠렛을 재현탁합니다.
7. 얼음에서 세포를 초음파 처리(500W, 20kHz, 40% 진폭, 15분 동안 9초 켜기, 11초 끄기)하고 20,000 x g에서 원심분리하여 용해성 물질을 수확합니다.
8. 용해성 용해물을 원뿔형 플라스크에 옮기고 수지 2mL를 추가합니다(재료 표 참조). 105 rpm 회전으로 1 시간 동안 배양
   메모: 이 IMAC 단계에는 니켈 세파로스도 사용할 수 있습니다.
9. 수지를 수확하고 250mL의 IMAC 버퍼 A로 세척한 다음 500mL의 IMAC 버퍼 B(20mM 인산나트륨 pH 7.5, 500mM NaCl, 7mM 이미다졸, 1mM β-메르캅토에탄올)로 세척합니다.
   메모: 니켈 세파로스 수지를 사용하는 경우 50mM 이미다졸로 증가시킵니다.
10. IMAC 완충액 C(20mM sodium phosphate pH 7.5, 500mM NaCl, 300mM imidazole, 1mM β-mercaptoethanol)를 사용하여 His6 태그 단백질을 용리화합니다.
11. 10mM HEPES pH 7.5, 150mM NaCl 및 1mM DTT에서 평형을 이룬 크기 배제 컬럼(재료 표 참조)에 주입합니다. FKBP12F36V는 우리가 사용한 컬럼에서 87.71mL의 최대 용리를 가지고 있습니다.
12. SDS-PAGE를 통해 순도를 평가하고 필요에 따라 풀링하고 농축합니다.

2. 멀티웰 플레이트 어레이 준비

1. 정제된 FKBP12F36V(또는 관심 단백질로 표시)을 -80°C에서 해동합니다.
2. 100nM 정제 FKBP12F36V(중간, 10mM HEPES pH 7.5, 150mM NaCl, 1mM DTT) 용액을 준비합니다. 초음파 처리 및 원심 분리기 (13,000 rpm의 빠른 회전)로 응집체 형성을 방지합니다.
3. 100 - 200 μL를 유리 바닥이 있는 8웰 관찰 챔버에 피펫팅합니다.
4. BB 이량체를 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 및 500nM의 최종 농도에 추가합니다.
5. 참고로, 100nM의 mVenus 단독 용액을 준비하여 잠재적인 응집 및 침전 효과를 평가하고 동일한 획득 설정으로 단량체에 대한 밝기 값을 복구합니다.

3. 캘리브레이션이 필요 없는 공초점 획득

1. 컨포칼 시스템을 시작합니다(그림 1). 디지털 검출기 또는 잘 특성화된 아날로그 검출기가 장착되어 있고 획득된 모든 픽셀에 대해 일정한 체류 시간을 유지할 수 있는 모든 광학 스캐닝 현미경 컨포칼 시스템이 작동합니다.
2. 여기 빔 경로 설정:
   1. 514nm 레이저를 켜고 대물렌즈 출구에서 20 - 100nW 전력으로 설정합니다(FKBP12F36V-mVenus의 경우).
   2. 63X1.4NA 대물렌즈 또는 FCS용으로 설계된 보정환 보정 침수 대물렌즈를 선택합니다.
   3. 하나의 HyD, APD 또는 보정된 PMT 감지기를 켭니다. 광자 계수가 가능한 검출기가 바람직한데, 이 경우 S, 오프셋 및 σ₀²의 계산이 필요하지 않기 때문입니다.
   4. 520 - 560 nm에서 방출 창을 선택합니다.
   5. 해당 방출 ~1nm에 대해 핀홀을 545 Airy 단위로 설정합니다.
   6. 획득 모드를 16 x 16 픽셀로 설정합니다.
   7. t_프레임 >> T_D >> t_dwell을 충족하도록 픽셀 체류 시간 t_dwell을 설정하며, 여기서 T_D는 확산 단백질의 체류 시간이고 t_frame은 프레임 속도입니다. 이는 체류 시간을 ~13μs.
      로 설정하는 것과 일치했습니다. 메모: 일부 상용 제조업체에는 픽셀당 체류 시간을 일정하게 유지하지 않는 스캐너가 있었습니다. 이 불변성은 방법이 작동하는 데 매우 중요합니다.
   8. 픽셀 크기를 ~120nm로 설정합니다.
   9. xyt 획득 모드를 선택하고 획득 및 웰당 획득할 프레임 수(예: 5,000)를 선택합니다.
   10. 시스템에 고처리량 모드가 장착되어 있는 경우 각 웰의 좌표와 웰당 수집 횟수를 도입하여 프로세스를 자동화합니다.
       메모: 침수 대물렌즈를 사용하는 경우 물 디스펜서가 있는지 확인하십시오.
   11. 시스템에 관류 시스템이 장착된 경우 BB 용액을 로드하고 5000^번째 프레임 직후에 관류가 시작되도록 관류를 프로그래밍하여 예를 들어 10,000개의 이미지를 획득하는 동안 이합체화의 역학을 평가합니다.
3. FCS용으로 설계된 칼라 보정 침수 대물렌즈를 사용하는 경우 오일 이멀젼 대물렌즈/물에 오일 한 방울을 추가합니다.
4. 8웰 관찰 챔버를 무대에 장착합니다.
5. 올바른 웰을 선택하고 솔루션에 초점을 맞춥니다.
   메모: 중요 : 반사 및 산란을 방지하기 위해 하단 유리 가까이에서 초점을 맞추지 마십시오. 솔루션에 더 깊이 초점을 맞출 때 자동 초점 옵션을 분리하십시오.
6. 획득을 시작하고 결과 이미지 스택을 TIFF 형식으로 저장합니다.

4. R 패키지 nandb를 사용한 Detrend 및 밝기 분석

1. 전처리 품질 검사로 그림 2a와 같이 ImageJ를 사용하여 이미지를 살펴보고 강도 프로파일을 복구합니다. 이것은 너무 많은 광백화가 발생했는지 여부를 확인하는 데 유용합니다. 백화가 너무 많으면 데이터를 추가 분석에 적합하지 않게 됩니다.
   메모: ImageJ는 상용 형식에서 TIFF로 이미지를 변환하는 데에도 유용할 수 있습니다. 아래에 설명된 nandb 소프트웨어는 TIFF 파일에서만 작동할 수 있습니다.
2. R 및 RStudio를 다운로드하여 설치합니다. R을 먼저 다운로드하여 설치한 다음 RStudio.
   를 다운로드하여 설치하는 것이 가장 좋습니다. 메모: 다음은 nandb R 패키지를 사용하는 방법에 대한 설명입니다. nandb를 사용하는 데 R 언어에 대한 지식이 필요하지는 않지만 삶이 더 쉬워집니다.
3. nandb 패키지를 설치합니다.
   1. RStudio를 열고 콘솔에서 install.packages("nandb")를 입력하고 설치를 기다립니다.
4. nandb에 대해 알아보기
   1. 설명서를 검토하십시오.
   2. 다양한 기능에 대한 기본 제공 RStudio 도움말을 검토하십시오. 가장 많이 사용되는 함수는 brightness() 입니다. ?를 입력하여 이 함수에 대한 도움말 파일을 봅니다. brightness()를 실행합니다.
5. 밝기 계산
   1. 데스크탑에 img001.tif라는 이미지 파일이 있다고 가정 해 보겠습니다 ( 'nandb'는 TIFF 파일에서만 작동합니다). 해당 이미지의 밝기를 계산할 수 있습니다.
      b <- 밝기("~/Desktop/img001.tif", tau = "자동")
      1. 이렇게 하면 이미지의 밝기가 R의 변수 b에 할당됩니다. tau = "auto"는 밝기를 계산하기 전에 이미지가 올바르게 디트렌드되도록 합니다. 여기에서 수행할 가장 일반적인 작업은 이미지의 평균 또는 중간 밝기를 계산하는 것입니다. mean(b) 또는 median(b)을 입력하여 이 작업을 수행할 수 있습니다.
         를 사용하여 데스크탑에 밝기 이미지를 쓸 수도 있습니다. ijtiff::write_tif(b, "~/데스크톱/whatever_img_name")
   2. 바탕 화면에 images_folder 이미지로 가득 찬 폴더가 있고 이러한 이미지의 밝기를 계산하고 밝기 이미지를 TIFF 파일로 작성해야 한다고 가정해 보겠습니다. 그런 다음 ?brightness_folder()를 참조하십시오. 이 함수는 전체 폴더를 한 번에 처리합니다.
      brightness_folder("~/Desktop/images_folder", tau = "auto")
      이것은 모든 파일이 하나의 단일 명령으로 처리되기 때문에 R보다 선호하는 소프트웨어를 가진 사람들에게 특히 좋으며, ImageJ, Python 또는 다른 소프트웨어에서 출력 밝기 TIFF 이미지로 계속 작업 할 수 있습니다.

그림 1. 용액에서 단백질 단량체-이량체 전이를 감지하기 위한 N&B의 적용. (a) 레이저 소스(mVenus 표지 단백질의 경우 514nm로 설정)가 장착된 레이저 스캐닝 현미경(LSM)의 단순화된 광학 경로(파란색 화살표)를 FKBP12F36V-mVenus 용액의 100nM 용액을 비추는 침지 대물렌즈(이 경우 63X1.4NA 오일)로 향합니다. 방출 형광(녹색 화살표)은 이색성 거울을 통과하여 방출광을 청소하는 대역통과 필터와 광자 계수가 가능한 포인트 디지털 검출기 바로 앞에 위치한 1 Airy 장치에 설정된 핀홀을 향합니다. (b) 16 x 16 픽셀을 통해 컨포칼 부피의 조명을 스캔하여 가우스 모양의 공초점 부피에 들어오고 나가는 단일 FKBP12F36V-mVenus 분자를 비추어 형광 강도 변동의 배열을 생성합니다. (c) 시간이 지남에 따라 획득된 이미지 시리즈

그림 2. 용액 내 단량체 모집단을 정확하게 측정하기 위해 자동 추세 제거가 필요합니다. (a) 프로토콜 섹션에 설명된 대로 5000개의 16 x 16 픽셀 이미지 스택을 획득했습니다. 첫 번째 프레임의 intensity는 평균 time-resolved intensity 프로파일과 함께 표시되며, 이는 표백 및 기타 용매 및/또는 광물리학 효과와 관련될 수 있는 장기적인 변동을 보여줍니다. 이러한 장기적인 변동의 원인이 무엇이든 밝기 계산에 영향을 미치므로 추세 제거가 필요합니다. 자동 추세 제거가 없으면 B = 1.026이 표시되고, 자동 추세 제거 후에는 B = 1.005가 됩니다. 또한 부드러운 필터링이 없는 밝기(왼쪽 패널, 두 번째 행)와 부드러운 필터링이 있는 밝기(오른쪽 패널, 두 번째 행)가 표시됩니다. (b) (a)에 제시된 것과 동일한 데이터가 추세를 제거하였고, 그 결과를 강도 및 밝기 측면에서 표시하였다.