$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 복제
- 복제할 구성을 결정하고 링커를 선택합니다. 아래에 설명된 대로 N- 또는 C-말단에 있는 단편으로 단백질을 태그하여 적절한 국소화를 방해하지 않도록 합니다. (GGGGS)x2와 같은 유연한 링커를 사용합니다.
- PAmCherry1 단편에 관심 단백질을 유전적으로 태그합니다. 한 가지 옵션으로, 플랭크 MCS 염기서열과 함께 RN (PAmCherry1 잔기 1-159) 및 RC(Met plus PAmCherry1 잔기 160-236)를 포함하는 Materials List에 나열된 클로닝 플라스미드를 사용합니다.
- 삽입 지점에서 inverse PCR(또는 제한 분해물)로 RN 및 RC 단편을 포함하는 플라스미드를 선형화합니다. Inverse PCR에 대한 프라이머는 표 1에 나열되어 있습니다. 다음은 저자의 연구실에서 사용된 PCR 프로토콜의 예입니다(이 프로토콜에 사용된 정확한 재료는 재료 목록 참조).
- PCR 반응을 함께 혼합하여 물과 함께 최종 부피 50μl까지 끌어오기: 얇은 벽 PCR 튜브에 물, 2x 마스터 믹스 25μl, 정방향 및 역방향 프라이머(20μM 희석 원료, 0.2μM 최종 농도) 각 0.5μl 및 템플릿 1ng를 추가합니다. 98°C에서 30초, 98°C에서 30회 7초, 68°C에서 2분, 72°C에서 10분 동안 최종 연장을 사용하십시오.
- PCR RN 및 RC 단편을 포함하는 선형화된 플라스미드에 삽입하기 위한 관심 유전자. 68°C에서 확장 시간으로 1.2.1단계와 같이 PCR을 수행합니다. (GGGGS)x2에 대한 GGAGGTGGAGGTAGTGGGAGGTGGAG와 같은 유연한 링커 서열과 재조합을 위해 선형화된 RN 및 RC 플라스미드 말단에 대한 15개의 염기쌍 상동성을 포함하는 돌출부가 있는 프라이머를 사용합니다.
메모: 관심 단백질에 대한 프라이머 돌출부는 플라스미드 골격을 선형화하기 위해 표 1의 프라이머를 사용하는 경우 표 2에 제시되어 있습니다.
- PCR 주형을 제거하기 위해 Dpn1로 PCR 반응을 분해합니다. 0.5 μl의 Dpn1 (20 U/μl)을 PCR 반응의 50 μl에 직접 첨가합니다. 37°C에서 1시간 동안 배양하고 80°C에서 20분 동안 가열비활성화합니다. 백그라운드 템플릿이 이후 단계에서 지속되면 효소 양을 늘리거나 분해 시간을 연장합니다.
- 제조업체가 설명한 대로 스핀 컬럼을 통해 PCR 산물을 정제합니다.
- RN 또는 RC 단편을 포함하는 선형화된 플라스미드를 관심 유전자와 결합하기 위해 ligation-independent 반응을 수행합니다. 정제된 PCR 산물의 농도 측정: 50ng의 선형화된 플라스미드와 50ng의 관심 유전자를 1μl의 효소 프리믹스와 결합하고 탈이온수로 총 부피를 5μl로 가져옵니다. 50°C에서 15분 동안 배양하고 얼음 위에 놓고 TE 완충액 20μl를 추가합니다.
- 재조합 플라스미드를 유능한 박테리아로 변환합니다.
- O/N 배양을 위해 2-4+(원하는 대로) 콜로니를 선택합니다. 14ml 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브에 LB 육수 5ml와 카나마이신 5μl(50mg/ml 스톡)를 넣고 멸균된 접종 루프로 선택한 박테리아 콜로니를 추가합니다. 225rpm으로 흔드는 동안 37°C O/N에서 배양합니다.
- 글리세롤 스톡을 위해 O/N 배양 1ml를 동결하고 제조업체에서 설명한 대로 나머지를 최소화합니다.
- 염기서열분석을 수행하여 양호한 클론을 결정합니다. Materials List에서 클로닝 플라스미드를 사용하는 경우, 필요에 따라 M13 정방향 및 역방향 프라이머(별도 반응)를 사용하여 융합 구조체의 완전한 염기서열을 얻을 수 있습니다. NCBI(National Center for Biotechnology Information) - http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi 의 BLAST와 같은 정렬 도구를 사용하여 예상되는 염기서열과 비교합니다.
- 염기서열 검증 구조체를 재조합효소 반응을 통해 발현 플라스미드로 전달합니다.
- 75 ng의 destination plasmid(일시적 transfection을 위한 pcDNA 또는 lentiviral packaging을 위한 pLenti)와 50 ng의 재조합 클로닝 플라스미드를 1 μl의 enzyme premix에 첨가하고 탈이온수로 총 부피를 5 μl로 늘립니다. 25 °C에서 1 시간 동안 배양 한 다음 5 μl의 TE buffer.
를 첨가하십시오.
메모: 렌티바이러스 패키징 및 안정적인 세포주 생성을 위해 각 구성물에 대해 다른 destination plasmid를 사용합니다(예: 하나는 puromycin 저항성이 있고 다른 하나는 neomycin이 있음). 이를 통해 형질도입된 세포를 이중 선택할 수 있습니다. 또한 높은 발현 수준을 위한 구성적 거대세포바이러스(CMV) 프로모터 또는 튜너블 독시사이클린 조절 발현을 위한 TetO 연산자가 있는 CMV와 같은 각각에 대한 promoter를 고려하십시오.
- 5 μl를 유능한 박테리아로 변환하고 1.2.6 - 1.2.8 단계에서와 같이 적절한 항생제(일반적으로 암피실린)를 사용하여 플라스미드를 최소화합니다.
- 최적의 BiFC 구성을 결정합니다.
- Co-transfection 발현 플라스미드를 U2OS 세포(또는 선택한 세포)로 변환합니다.
- 10% FBS가 보충된 350μl의 페놀 무함유 및 무항생제 DMEM을 8웰 #1.5 유리 바닥 챔버 슬라이드의 각 웰에 추가합니다. 플레이트: 웰당 약 7.5 x 10,4개의 셀이 있으므로 세포는 다음날 약 70%-90%가 합류합니다.
- 도금 다음날, 선호하는 시약을 사용하고 제조업체가 설명한 대로 각 웰에서 서로 다른 구성의 co-transfection 발현 플라스미드를 투여합니다.
- 각 웰에 대해 각 발현 플라스미드 125ng을 0.6ml 튜브에 있는 50μl의 무혈청 환원 배지에 넣고 위아래로 피펫하여 혼합합니다. 1 μl의 transfection 시약을 튜브 중앙을 따라 배지에 직접 추가합니다. 부드럽게 저어 섞고 반응을 30분 동안 그대로 두십시오.
- 챔버 슬라이드의 각 웰에 있는 매체를 약 절반으로 줄입니다. transfection 혼합물을 웰에 적가하고 부드럽게 흔들어 섞습니다. 37-48시간 동안 37°C 및 5% CO2에서 세포를 배양합니다. transfection 다음날 배지를 교체하십시오.
- 프로토콜 2에서와 같이 2.1.4.
단계로 시작하는 형광 현미경의 이미지 세포
메모: 발현 수준이 높고 카메라가 PAmCherry1의 상대적으로 낮은 광자 출력에 충분히 민감한 경우 표준 형광 현미경에서 샘플을 이미지화할 수 있습니다. 재구성된 PAmCherry1 분자는 녹색 여기(561nm) 필터 세트로 이미징하기 전에 자외선 필터 세트(405nm)로 활성화할 수 있습니다.
- 해당되는 경우, 예를 들어, 상호 작용을 방해하는 관심 단백질 중 하나에 점 돌연변이를 도입하여 음성 대조군을 만듭니다. 돌연변이가 발생할 단백질과 선택한 구성의 클로닝 플라스미드에 대해 부위 지시 돌연변이 유발을 수행합니다.
- 구조체를 바이러스 입자로 패키징하고 U2OS 세포(또는 선택한 세포주)를 감염시켜 안정적인 세포주를 생성합니다. BiFC의 장기간의 비가역성이 문제이거나 조정 가능한 발현이 필요한 경우 이미징 전에 발현을 유도할 수 있도록 유도성(tetracycline) 발현 시스템을 고려하십시오.
주의: 바이러스에 대한 작업은 생물 안전 레벨 2로 분류됩니다. 최근 세대의 바이러스 패키징 시스템으로 인해 복제 가능한 바이러스가 생성될 가능성이 크게 감소했지만 일부 위험은 여전히 존재합니다. 참고 문헌은 http://www.cdc.gov/ biosafety/publications/에서 찾을 수 있습니다.
- 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 목적지 벡터를 사용하여 1.2.10단계를 반복합니다. O/N 배양을 100ml로 증가시켜 midiprep과 플라스미드의 순도를 높입니다.
- 1일차: 약 2 x 106 293T/17 셀을 포장할 각 구조체에 대해 10cm 접시에 플레이트합니다.
- 2일차: 제조업체가 설명한 대로 선택한 형질주입 시약을 사용하여 형질주입 반응을 준비합니다.
- 플라스미드 1 및 2 포장을 위한 최종 농도가 250 ng/μl, 멸균 수에서 플라스미드 3을 포장하기 위한 100 ng/μl의 포장 플라스미드 프리믹스를 준비합니다. 패킹 플라스미드 프리믹스 10 μl와 타겟 플라스미드 2.5 μg을 5 ml 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브와 피펫에 1 ml의 무혈청 환원 배지에 첨가하여 혼합합니다. 20μl의 transfection 시약을 튜브 중앙을 따라 배지에 직접 추가합니다.
- 부드럽게 교반하여 혼합하고 RT에서 30분 동안 배양합니다. 세포에서 배지의 약 절반을 제거하고 적방울 방식으로 transfection 혼합물을 추가합니다. 부드럽게 흔들어 섞고 37 ° C 및 5 % CO2에서 배양합니다. 온도와 CO2 평형을 위해 캡을 느슨하게 한 튜브에서 플레이트당 10ml의 배지를 배양합니다.
- 3일차: 사전 배양된 배지로 배지를 부드럽게 교체하고 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 캡을 느슨하게 한 상태에서 다른 배지 튜브를 배양합니다. 참고: Syncytia 또는 큰 다핵 세포의 형성은 포장이 잘 진행되고 있다는 신호일 수 있습니다. 그러나 세포는 취약한 상태이며 쉽게 분리될 수 있습니다. 매체를 교체할 때 피펫터를 수평이 되도록 기울이고 플레이트의 한쪽 가장자리에 매체를 떨어뜨려 추가합니다.
- 4일차: 주사기로 배지를 제거하고 0.45μm 공극 크기의 필터를 통해 깨끗한 50ml 튜브에 여과하여 바이러스를 수확합니다. 배지를 사전 배양된 배지로 부드럽게 교체합니다.
- 5일차: 이전 1.5.3.3 단계에서 했던 것처럼 다시 수확하고 공통 여과액을 동일한 50ml 튜브에 결합합니다. 각 튜브에 바이러스 농축기 6ml를 넣고 섞습니다. 바이러스가 침전될 때까지 최소 24시간 동안 4°C에서 보관하십시오.
메모: 세포의 건강 상태에 따라 바이러스는 세 번째로 수확될 수 있습니다.
- 1,500 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리하여 바이러스를 농축합니다.상등액을 흡인하고 펠릿을 250μl의 배지에 재현탁합니다. 바이러스는 감염에 즉시 사용하거나 -80 °C에서 최대 1년 동안 50 μl 분취액에 보관할 수 있습니다.
- 감염을 위해 웰당 약 3 x 105 U2OS(또는 표적) 세포를 6웰 플레이트(웰당 10% FBS가 있는 DMEM 2ml)에 플레이트하여 감염 시 세포가 약 50% 융합되도록 합니다.
- 다음 날, 약 1ml가 남도록 매체의 절반 정도를 제거합니다. 각 구조에 대해 50μl의 농축된 바이러스로 동시 감염합니다. 각 웰에 1μl의 폴리브레렌(8mg/ml)을 추가합니다. 37 ° C 및 5 % CO2에서 배양하십시오. 다음날 배지를 교체하고 항생제 선택 전에 하루 더 배양합니다.
메모: 추가할 바이러스의 양은 원하는 감염 속도에 따라 달라질 수 있습니다. qRT-PCR을 사용하여 바이러스를 적정할 수 있습니다.
- 감염된 세포를 선택하기 위해 항생제를 추가합니다. 바이러스를 본 적이 없는 감염되지 않은 세포가 있는 별도의 웰은 선택의 효능을 테스트하기 위해 카나리아로 필요합니다. 2-7일 동안 또는 선택이 완료될 때까지 배양합니다.
메모: 유효 농도는 초기에 적정해야 하지만 일반적으로 퓨로마이신의 경우 1.0μg/ml, 네오마이신의 경우 1.0mg/ml입니다.
- 세포를 10cm 더 큰 접시로 확장하고 프로토콜 2로 진행합니다.
2. 고정 세포 이미징
- 이미징을 위한 샘플 준비
- 8-well #1.5 유리 바닥 챔버 슬라이드를 250μl의 1M NaOH를 최소 1시간 동안 첨가하여 세척하고 PBS.
로 철저히 세척합니다.
메모: 처리되지 않은 챔버 슬라이드는 일반적으로 높은 배경 신호를 생성합니다. 또한 세포는 잔류 NaOH에 민감할 수 있으며 유리 표면을 철저히 청소하지 않으면(최대 10회 세척) 세포 접착이 어려울 수 있습니다. 필요한 경우 세척 후 세척된 챔버 슬라이드를 PBS O/N으로 배양합니다. 민감한 세포주의 경우 더 높은 밀도(예: 50%-60% 초기 포화도)로 도금하는 것이 도움이 될 수 있습니다.
- 플레이트: 350μl의 페놀 레드가 없는 DMEM에 웰당 약 5.5 x 104개의 U2OS 안정 발현 세포를 10% FBS로 플레이트하여 세포가 건강하고 이미징 시 과도하게 합류하지 않도록 합니다.
- 단백질 발현을 유도하기 위해 테트라사이클린을 첨가하는 등 실험에 필요한 처리를 수행합니다.
- 이미징 직전에 세포를 고정합니다.
- 고정하기 전에 새로운 파라포름알데히드(PFA) 용액(0.1% 글루타르알데히드(GA)과 함께 1x PHEM에 3.7% PFA)를 준비합니다. 10ml PFA 용액의 경우 0.37g의 PFA를 계량하고 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 증류수 1ml와 30μl의 1M NaOH와 와류를 추가합니다. 70 °C에서 가열하고 PFA가 완전히 용해될 때까지 1-2분마다 소용돌이칩니다.
- 용해된 PFA를 15ml 원뿔형 튜브에 옮기고 증류수 3.8ml, 2x PHEM 완충액 5ml, 25% 글루타르알데히드 20μl, 와류를 첨가하여 혼합합니다. 스톡, 2x PHEM 버퍼는 120mM PIPES, 50mM HEPES, 20mM EGTA 및 16mM MgSO4이며 pH는 10M KOH로 7.0으로 조정됩니다. 이 정착 용액은 4 °C에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다 .
주의: PFA와 GA는 모두 위험합니다. 흄 후드에 용액을 준비하고 두 화학 물질을 모두 취급할 때 적절한 보호 장비를 착용하십시오. 흡입이나 직접적인 피부 접촉을 피하십시오.
- 성장 매체를 제거합니다. 500μl의 PBS로 빠르게 세척하고 웰당 250μl의 PFA 고정제를 추가합니다. RT에서 20분 동안 세포를 배양합니다.
- 샘플에서 PFA 고정제를 제거하고 웰당 350μl의 PBS 또는 이미징 버퍼(30mM NaCl 및 20mM MgCl2, pH 8.5의 100mM Tris)를 추가합니다.
- Vortex 100nm 금 입자는 응집체를 분해하고 이미징 중 단계 이동을 추적하기 위해 웰당 35μl(최종 희석 10배)를 추가합니다.
- 이미지 획득
- 현미경을 켭니다. 405 및 561nm 레이저의 전원을 켜되 이 시점에서 셔터(내부 또는 외부)를 닫아 두십시오. EMCCD 카메라를 켜고 식히십시오. 561nm 필터가 장착되어 있는지 확인합니다.
- 획득 소프트웨어를 열고 노출 시간을 100msec로 설정하고 EMCCD 게인을 300(범위 1 – 1,000)으로 설정합니다.
- 대물렌즈에 이멀젼 오일을 추가하고 샘플을 현미경 스테이지에 고정합니다.
- 명시야 또는 561nm 레이저를 켠 상태에서(~1kW/cm2 ) 샘플에 초점을 맞춥니다.
- Ras 및 기타 멤브레인 단백질을 이미징하려면 1.49 개구수를 가진 60X 아포크로맷 TIRF 대물렌즈를 사용하고 현미경을 TIRF 구성으로 가져옵니다. 여기 레이저를 조정하여 TIRF 대물렌즈의 뒤쪽 조리개를 칠 때 중심에서 벗어나도록 합니다. 이로 인해 레이저가 샘플에 도달할 때 편향됩니다. 임계각에 도달하고 레이저가 다시 반사될 때까지 레이저를 계속 조정하십시오. 여러 금 입자가 보이는 이미지를 만들 셀을 검색합니다. 셀(또는 셀 내의 영역)과 금 입자를 둘러싸는 관심 영역을 설정합니다.
참고: TIRF는 여기 레이저의 침투 깊이를 줄이고 초점을 벗어난 배경 신호를 줄입니다. 또한 드리프트 보정은 더 많은 금 입자가 보일 때 더 정확할 수 있습니다.
- 가능한 경우 자동 초점 시스템을 작동하여 z 방향의 샘플 드리프트를 수정합니다. 그렇지 않으면 이미지의 초점이 맞지 않을 경우 획득하는 동안 초점을 수동으로 조정하십시오.
- 이미 충분한 활성화가 이루어지고 있는 경우(일반적으로 발현 수준이 높은 경우) 405nm 레이저를 끄고 561nm 레이저를 켠 상태(~1kW/cm2)로 획득을 시작합니다. 그렇지 않으면 가장 낮은 공장 출력 설정(0.02mW 또는 0.01W/cm2)에서 405nm 레이저를 켜고 프레임당 수십 개의 분자가 있거나 단일 분자가 잘 분리될 때까지 필요에 따라 점진적으로(한 번에 0.1mW) 증가시킵니다.
- 데이터 수집이 계속됨에 따라 405nm 레이저 출력을 점진적으로 증가시켜 스폿 밀도를 거의 일정하게 유지합니다. 참고: 낮은 405nm 여기 전력에서는 일부 PAmCherry1이 이미 활성화되었을 수 있습니다. 이러한 분자가 광표백됨에 따라 남아 있는 광활성성 PAmCherry1 분자의 개체군이 감소하므로 각 프레임에서 형광을 방출하는 분자의 동일한 밀도를 유지하기 위해 더 높은 광자 플럭스가 필요합니다.
- 높은 405nm 출력(2.5 – 10W/cm2)이 더 많은 활성화 이벤트를 활성화하지 않을 때까지 이미지 획득을 계속합니다.
메모: 총 획득 시간은 보완의 표현 수준과 효율성에 따라 달라집니다.
표 1. PAmCherry1 단편을 포함하는 클로닝 플라스미드를 선형화하기 위한 프라이머. RN 및 RC를 포함하는 클로닝 플라스미드는 단편의 N- 또는 C-말단의 삽입 지점에서 Inverse PCR로 선형화할 수 있습니다. 시퀀스는 5'에서 3'으로 나열됩니다.
| 프라이머 시퀀스 (5' - 3') |
| N-terminus reverse에 삽입하기 위한 클로닝 플라스미드 | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| N-말단 순방향의 RN | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| RC at N-terminus forward | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| C-terminus forward에 삽입하기 위한 클로닝 플라스미드 | 타아 |
| C-terminus reverse의 RN | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC |
| C-terminus reverse에서 RC | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
표 2. 표 1 프라이머와 일치하는 관심 유전자 프라이머의 돌출부.
결찰 독립 반응을 위한 15개의 염기쌍의 상동성은 프라이머 돌출부에서 생성됩니다. 또한, 오버행은 (GGGGS)x2 플렉시블 링커에 대한 시퀀스를 포함한다. 대신에 유연한 링커 서열은 표 1의 프라이머에 추가될 수 있다. 시퀀스는 5'에서 3'으로 나열됩니다.
그
그
| 관심 유전자 프라이머에 대한 돌출부(5' to 3') |
| N-단자 삽입 RN 또는 RC 포워드 | GAGCTCGGTACCATG |
| N-단자 삽입 RN 리버스 | ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC |
| N-단자 삽입 RC 리버스 | ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| C-말단 삽입 RN 정방향 | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGG
아그타그트 |
| C 단자 삽입 RC 포워드 | GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGG
아그타그트 |
| C-단자 삽입 RN 또는 RC 리버스 | GCGCCCACCCTTTTA |