Fluorescence Anisotropy-based Detection of Protein-Protein Interaction(단백질-단백질 상호작용의 형광 비등방성 기반 검출)

1. FlAsH 형광 염료 4',5'-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) Fluorescein을 사용한 SBDS-FlAsH의 라벨링

1. SBDS-FlAsH 단백질 3 nmol (FlAsH-태그는 재조합 SBDS 단백질의 C 말단에서 유전적으로 조작 된 테트라시스테인 모티프 Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys에 해당)을 5 μl 부피의 이등방성 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 10% 글리세롤, 5mM β-메르캅토에탄올).
2. 4°C에서 8시간 동안 반응을 진행시킵니다.밤새 이방성 완충액에 대해 샘플을 투석하여 유리 염료를 제거합니다.
3. Lambert-Beer 법칙을 사용하여 표지된 단백질의 %를 정량화합니다. 적절한 부피의 석영 큐벳을 사용하여 분광 광도계에서 280nm 및 508nm에서 흡광도를 측정합니다. 메모: 다음 몰 흡수 계수 (^{M-1 cm-1})를 고려하십시오 :
   수식 1
4. 방정식 2.
   를 사용하여 표지된 SBDS-FlAsH 단백질의 농도를 계산합니다. 수식 2
5. 이전 단계에서 계산된 C_SBDS-FlAsH를 대입하여 방정식 3을 사용하여 총 SBDS 단백질의 농도를 계산합니다.
   수식 3
6. 방정식 4.
   을 사용하여 표지된 단백질의 백분율을 계산합니다. 수식 4

2. 형광 이방성 실험

참고: 이방성 실험은 편광 도구 상자가 장착된 분광형광계에서 수행되었으며 데이터 수집은 장비 소프트웨어에 제공된 이방성 프로그램을 사용하여 수행되었습니다. 여기 파장은 8nm의 스펙트럼 대역폭으로 494nm로 설정되었으며 방출은 530±25nm의 대역 통과 필터를 사용하여 기록되었습니다. 측정은 경로 길이가 5mm인 200μl 큐벳에서 25°C에서 수행되었습니다.

1. 형광 큐벳에서 200μl의 30nM SBDS-FlAsH를 이방성 완충액에 넣고 2μl의 30μM EFL1을 적정합니다. 완전히 혼합하고 이방성 값을 측정하기 전에 반응을 3분 동안 그대로 두십시오.
2. 총 부피 40μl의 EFL1이 추가될 때까지 2.1단계를 반복합니다.

3. 데이터 분석

1. 비선형 최소 제곱 회귀 알고리즘을 사용하여 데이터를 적절한 바인딩 모델에 맞춥니다. 가장 일반적인 바인딩 모델에 대한 방정식이 표 1에 제시되어 있습니다.
2. 적합치의 잔차를 검사하여 단백질 간의 상호 작용을 설명하는 최상의 모형을 평가합니다. 추가 실험으로 선택한 모델을 지원합니다.

표 1. 일반적인 단백질-단백질 상호 작용 결합 모델 및 이를 설명하는 수학 방정식.