transcription factor-DNA 복합체 검출을 위한 전기영동 이동성 전환 분석

초록

출처: Hsieh, Y. W. et al., 적외선 형광 염료 표지 올리고뉴클레오티드를 사용한 전기영동 이동성 이동 분석에 최적화된 프로토콜. J. Vis. 특급. (2016년)

이 비디오에서는 적외선 형광 표지 DNA 프로브를 사용하여 단백질-DNA 상호 작용을 감지하는 전기영동 이동성 이동 분석을 시연합니다. 단백질이 DNA 프로브에 결합할 때, 천천히 이동하며 겔에 이동된 밴드로 나타나는 큰 복합체를 형성합니다.

프로토콜

1. 결합 반응 및 전기 영동

1. 50 μL의 1 M Tris-HCl, pH 7.5; 10 μL의 5 M NaCl; 200 μL의 1 M MgCl₂, 1 M MgCl 2의 5 μL, 0.5 M EDTA의 10 μL, pH 8.0; 5 μL의 1 M DTT; 25 μL의 10 mg / mL BSA를 혼합하여 5x 결합 완충액의 1 mL를 준비합니다. 및 695μL의 ddH₂O.
   메모: 5x 결합 완충액은 분주하여 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. 고려해야 할 또 다른 점은 서로 다른 전사 인자(transcription factor)가 결합 완충액에 다른 변형을 가진다는 것입니다.
2. 결합 반응을 설정하기 직전에 0.5x TBE + 2.5% 글리세롤에 5% 천연 폴리아크릴아미드 겔을 사전 실행하여 80V에서 30 - 60분 동안 또는 전류가 더 이상 시간에 따라 변하지 않을 때까지 과황산암모늄의 모든 흔적을 제거합니다.
3. 20 μL의 최종 부피에서 결합 반응을 설정합니다.
   1. 4 μL의 5x 결합 완충액, 80 - 200 ng 정제 단백질 A(50% 글리세롤, 즉 SOX-2), 1 μL의 0.1 μM 염료 접합 프로브(최종 농도: 5 nM) 및 ddH₂O를 혼합합니다.
   2. 선택 사항: 콜드 프로브 경쟁자가 필요한 경우 다양한 농도(2x, 10x, 25x, 50x, 100x 등)의 콜드 프로브를 추가합니다.
   3. 선택 사항: 단백질 A와 B(즉, SOX-2 및 LIM-4) 간의 상호 작용을 테스트할 때 80 - 200ng의 정제된 단백질 B(50% 글리세롤, 즉 LIM-4)를 추가합니다.
   4. 선택 사항: 핵 추출물 제제를 사용하고 단백질 A의 특이적 결합을 검증해야 하는 경우 단백질 A에 특이적인 항체(즉, anti-6xHis, anti-FLAG 등)를 추가합니다.
   5. 어둠 속에서 R/T에서 15분 동안 배양합니다.
4. 모든 결합 반응을 겔에 로드하고 원하는 거리까지 10V/cm로 겔을 실행합니다.

2. 이미징

참고: 젤은 고급 적외선 이미징 시스템으로 유리판에서 직접 스캔되었습니다. 그러므로, 젤은 더 분해되고 반복적으로 스캔될 수 있습니다(그림 1C 및 2). 주로 웨스턴 블롯을 위한 근적외선 형광 이미징 시스템도 젤을 스캔하기 위해 테스트되었지만 고급 적외선 이미징 시스템만이 좋은 해상도로 젤을 스캔할 수 있었습니다. 설명된 방법론은 특정 적외선 이미징 소프트웨어에 특정하지만 다른 소프트웨어 패키지가 사용될 수 있습니다.

1. 스캐너의 베드를 ddH₂O로 청소하고 잘 건조시킨 후 스캔합니다. 젤의 유리판을 닦아내고 젤이 들어 있는 플레이트를 스캐너 베드에 놓습니다.
2. 적외선 이미징 소프트웨어를 열고 '획득' 탭으로 이동합니다. 더 얇은 플레이트(1mm)를 스캐너 베드에 놓을 때 채널: 700, 강도: 자동, 해상도: 169μm, 품질: 중간, 초점 오프셋: 1.5mm 설정을 사용합니다. 더 두꺼운 플레이트(3mm)를 스캐너 베드에 놓을 때 채널: 700, 강도: 자동, 해상도: 84μm, 품질: 중간, 초점 오프셋: 3.5mm 설정을 사용합니다. 초점 오프셋은 유리판의 두께에 따라 다릅니다.
3. 스캐너에서 젤이 차지하는 영역을 선택합니다. '시작'을 클릭하여 스캔을 시작합니다.

결과

그림 1. 적외선 형광 염료 표지 올리고뉴클레오티드를 사용하는 fEMSA. (A) fEMSA의 흐름도. (B) 브로모페놀 블루 염료, 오렌지 G 및 dI-dC(1μg)가 fEMSA에 미치는 영향. 5 nM의 5'Dye-LIM-4 / SOX-2 프로브가 사용되었습니다. (C)LIM-4/SOX-2 원소의 SOX-2 표적 부위에 대한 6xHis-SOX-2^G73E의 결합 특이성을 보여주는 fEMSA. 5 nM의 5'Dye-LIM-4 / SOX-2 프로브가 사용되었습니다. LIM-4/SOX-2(M), 돌연변이 표적 부위. 겔은 전기영동 후 20분 및 40분에 스캔되었습니다. 전기영동 후 40분에 얻은 스캔된 이미지는 형광 대역 강도를 정량화하는 데 사용되었으며, 이는 콜드 프로브...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
30% 아크릴아미드/비스 용액, 37.5:1	바이오 라드	1610158	아크릴아마이드는 유해하고 독성이 있습니다.
소 혈청 알부민 분자 생물학 등급	뉴잉글랜드 바이오랩스	B9000S
5'IRDye700 표지 DNA 올리고	통합 DNA 기술	맞춤형 DNA 올리고	이들은 원고에서 5' 염료 표지 또는 적외선 형광 염료 표지 DNA 올리고라고 합니다. 이 회사는 5' IRDye 표지 DNA 올리고뉴클레오티드를 맞춤 합성할 예정입니다. 최소 100μM 스케일 합성 및 HPLC 정제가 필요합니다.
Mini-PROTEAN 수직 전기영동 셀	바이오 라드	1658000FC	장치
Odyssey CLx 적외선 이미징 시스템	LI-COR 생명공학	오디세이 CLx 적외선 Imagng 시스템	장치
Odyssey Fc 이미징 시스템	LI-COR 생명공학	Odyssey Fc 듀얼 모드 이미징 시스템	장치
Image Studio 소프트웨어(버전 4.0)	LI-COR 생명공학	Image Studio 소프트웨어	소프트웨어
오렌지 G	시그마-알드리치	O3756-25G	화학
6x 오렌지 로딩 염료			0.25% 오렌지 G; 30% 글리세롤
0.5x 티베			45 mM 트리스-보레이트; 1 mM EDTA
TE 1개			10 mM 트리스-HCl; 1 mM EDTA, pH8.0
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM 트리스-HCl, pH8.0; 1 mM EDTA
5x 바인딩 버퍼			50 mM 트리스-HCl, pH7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8.0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA