방법 논문

transcription factor-DNA 복합체 검출을 위한 전기영동 이동성 전환 분석

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Hsieh, Y. W. et al., 적외선 형광 염료 표지 올리고뉴클레오티드를 사용한 전기영동 이동성 이동 분석에 최적화된 프로토콜. J. Vis. 특급. (2016년)

이 비디오에서는 적외선 형광 표지 DNA 프로브를 사용하여 단백질-DNA 상호 작용을 감지하는 전기영동 이동성 이동 분석을 시연합니다. 단백질이 DNA 프로브에 결합할 때, 천천히 이동하며 겔에 이동된 밴드로 나타나는 큰 복합체를 형성합니다.

프로토콜

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1. 결합 반응 및 전기 영동

  1. 50 μL의 1 M Tris-HCl, pH 7.5; 10 μL의 5 M NaCl; 200 μL의 1 M MgCl2, 1 M MgCl 2의 5 μL, 0.5 M EDTA의 10 μL, pH 8.0; 5 μL의 1 M DTT; 25 μL의 10 mg / mL BSA를 혼합하여 5x 결합 완충액의 1 mL를 준비합니다. 및 695μL의 ddH2O.
    메모: 5x 결합 완충액은 분주하여 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. 고려해야 할 또 다른 점은 서로 다른 전사 인자(transcription factor)가 결합 완충액에 다른 변형을 가진다는 것입니다.
  2. 결합 반응을 설정하기 직전에 0.5x TBE + 2.5% 글리세롤에 5% 천연 폴리아크릴아미드 겔을 사전 실행하여 80V에서 30 - 60분 동안 또는 전류가 더 이상 시간에 따라 변하지 않을 때까지 과황산암모늄의 모든 흔적을 제거합니다.
  3. 20 μL의 최종 부피에서 결합 반응을 설정합니다.
    1. 4 μL의 5x 결합 완충액, 80 - 200 ng 정제 단백질 A(50% 글리세롤, 즉 SOX-2), 1 μL의 0.1 μM 염료 접합 프로브(최종 농도: 5 nM) 및 ddH2O를 혼합합니다.
    2. 선택 사항: 콜드 프로브 경쟁자가 필요한 경우 다양한 농도(2x, 10x, 25x, 50x, 100x 등)의 콜드 프로브를 추가합니다.
    3. 선택 사항: 단백질 A와 B(즉, SOX-2 및 LIM-4) 간의 상호 작용을 테스트할 때 80 - 200ng의 정제된 단백질 B(50% 글리세롤, 즉 LIM-4)를 추가합니다.
    4. 선택 사항: 핵 추출물 제제를 사용하고 단백질 A의 특이적 결합을 검증해야 하는 경우 단백질 A에 특이적인 항체(즉, anti-6xHis, anti-FLAG 등)를 추가합니다.
    5. 어둠 속에서 R/T에서 15분 동안 배양합니다.
  4. 모든 결합 반응을 겔에 로드하고 원하는 거리까지 10V/cm로 겔을 실행합니다.

2. 이미징

참고: 젤은 고급 적외선 이미징 시스템으로 유리판에서 직접 스캔되었습니다. 그러므로, 젤은 더 분해되고 반복적으로 스캔될 수 있습니다(그림 1C 및 2). 주로 웨스턴 블롯을 위한 근적외선 형광 이미징 시스템도 젤을 스캔하기 위해 테스트되었지만 고급 적외선 이미징 시스템만이 좋은 해상도로 젤을 스캔할 수 있었습니다. 설명된 방법론은 특정 적외선 이미징 소프트웨어에 특정하지만 다른 소프트웨어 패키지가 사용될 수 있습니다.

  1. 스캐너의 베드를 ddH2O로 청소하고 잘 건조시킨 후 스캔합니다. 젤의 유리판을 닦아내고 젤이 들어 있는 플레이트를 스캐너 베드에 놓습니다.
  2. 적외선 이미징 소프트웨어를 열고 '획득' 탭으로 이동합니다. 더 얇은 플레이트(1mm)를 스캐너 베드에 놓을 때 채널: 700, 강도: 자동, 해상도: 169μm, 품질: 중간, 초점 오프셋: 1.5mm 설정을 사용합니다. 더 두꺼운 플레이트(3mm)를 스캐너 베드에 놓을 때 채널: 700, 강도: 자동, 해상도: 84μm, 품질: 중간, 초점 오프셋: 3.5mm 설정을 사용합니다. 초점 오프셋은 유리판의 두께에 따라 다릅니다.
  3. 스캐너에서 젤이 차지하는 영역을 선택합니다. '시작'을 클릭하여 스캔을 시작합니다.

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결과

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그림 1. 적외선 형광 염료 표지 올리고뉴클레오티드를 사용하는 fEMSA. (A) fEMSA의 흐름도. (B) 브로모페놀 블루 염료, 오렌지 G 및 dI-dC(1μg)가 fEMSA에 미치는 영향. 5 nM의 5'Dye-LIM-4 / SOX-2 프로브가 사용되었습니다. (C)LIM-4/SOX-2 원소의 SOX-2 표적 부위에 대한 6xHis-SOX-2G73E의 결합 특이성을 보여주는 fEMSA. 5 nM의 5'Dye-LIM-4 / SOX-2 프로브가 사용되었습니다. LIM-4/SOX-2(M), 돌연변이 표적 부위. 겔은 전기영동 후 20분 및 40분에 스캔되었습니다. 전기영동 후 40분에 얻은 스캔된 이미지는 형광 대역 강도를 정량화하는 데 사용되었으며, 이는 콜드 프로브...

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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
30% 아크릴아미드/비스 용액, 37.5:1바이오 라드1610158아크릴아마이드는 유해하고 독성이 있습니다.
소 혈청 알부민 분자 생물학 등급뉴잉글랜드 바이오랩스B9000S
5'IRDye700 표지 DNA 올리고통합 DNA 기술맞춤형 DNA 올리고이들은 원고에서 5' 염료 표지 또는 적외선 형광 염료 표지 DNA 올리고라고 합니다. 이 회사는 5' IRDye 표지 DNA 올리고뉴클레오티드를 맞춤 합성할 예정입니다. 최소 100μM 스케일 합성 및 HPLC 정제가 필요합니다.
Mini-PROTEAN 수직 전기영동 셀바이오 라드1658000FC장치
Odyssey CLx 적외선 이미징 시스템LI-COR 생명공학오디세이 CLx 적외선 Imagng 시스템장치
Odyssey Fc 이미징 시스템LI-COR 생명공학Odyssey Fc 듀얼 모드 이미징 시스템장치
Image Studio 소프트웨어(버전 4.0)LI-COR 생명공학Image Studio 소프트웨어소프트웨어
오렌지 G시그마-알드리치O3756-25G화학
6x 오렌지 로딩 염료0.25% 오렌지 G; 30% 글리세롤
0.5x 티베45 mM 트리스-보레이트; 1 mM EDTA
TE 1개10 mM 트리스-HCl; 1 mM EDTA, pH8.0
1x STE100 mM NaCl; 10 mM 트리스-HCl, pH8.0; 1 mM EDTA
5x 바인딩 버퍼50 mM 트리스-HCl, pH7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8.0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA

재인쇄 및 허가

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태그

DNADNA

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