동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 마우스 뇌에서 PDGFRα 양성 희소돌기아교세포 계통 세포의 정제(이전에 설명된 면역 판닝 프로토콜에서 수정됨)
- PDGFRα 양성 세포 선택을 위한 면역판화 플레이트와 내피 세포 및 미세아교세포 고갈을 위한 2개의 플레이트를 준비합니다.
메모: 페트리 접시는 작동하지만 세포 배양 접시는 면역 판닝 실험에 작동하지 않습니다. 정제된 세포를 배양에 사용할 경우 생물 안전 캐비닛에서 면역 판닝 단계를 수행해야 합니다.
- 10cm 페트리 플레이트에 10mL의 pH 9.5, 50mM Tris-HCl에 30μL 염소 항 쥐 IgG를 4 ° C에서 하룻밤 동안 코팅합니다. 플레이트의 표면이 코팅 용액으로 균일하고 완전히 덮여 있는지 확인하기 위해 플레이트를 교반합니다.
- 0.2% BSA를 함유한 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 12mL로 rat anti-PDGFRα 항체 40μL를 희석하여 PDGFRα 항체 용액을 준비합니다.
- 10mL 1x DPBS로 IgG 코팅 플레이트를 3회 세척한 후 PDGFRα 항체 용액으로 IgG 코팅 플레이트를 실온에서 4시간 동안 배양합니다.
- rat anti-PDGFRα 항체 코팅 플레이트를 각각 10mL 1x DPBS로 3회 세척합니다. 플레이트의 측벽을 따라 DPBS 용액을 부드럽게 추가하고 코팅된 표면을 방해하지 마십시오.
- 내피 세포와 미세아교세포의 고갈을 위한 새로운 15cm 페트리 플레이트 2개를 2시간 동안 2.3μg/mL의 Banderiaea simplicifolia 렉틴 1(BSL-1)이 포함된 20mL의 DPBS로 코팅합니다.
- BSL-1 코팅 플레이트를 20mL 1x DPBS로 3회 세척합니다. 플레이트의 측벽을 따라 DPBS 용액을 부드럽게 추가하고 코팅된 표면을 방해하지 마십시오.
- PDGFRα 양성 희소돌기아교세포 계통 세포의 정제는 이전에 발표된 방법에서 변형되었습니다.
- 이전에 발표된 프로토콜에 따라 출생 후 2일째(P7) 마우스 뇌에서 피질 조직을 해부합니다.
- 조직을 해리하여 자세한 제조업체의 지침에 따라 신경 조직 해리 키트(P)를 사용한 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
- 간단히 해부된 피질 조직을 메스로 조각으로 자르고 37°C에서 효소 소화를 실시합니다. 소화 후, Fire-polished glass Pasteur 피펫으로 조각을 단일 세포 현탁액으로 수동으로 분리하십시오.
- 실온에서 300 x g의 단일 세포 현탁액을 10분 동안 원심분리하고 15mL의 면역판넬 완충액(면역판넬 완충액은 0.02% BSA 및 5μg/mL 인슐린이 함유된 DPBS임)을 사용하여 세포 펠릿을 현탁합니다.
- 2개의 BSL-1 코팅 플레이트에서 2개의 BSL-1 코팅 플레이트에 2개의 마우스 뇌에서 단일 세포 현탁액을 순차적으로 배양하고 5분마다 플레이트를 부드럽게 교반하여 미세아교세포와 내피 세포의 더 나은 고갈을 보장합니다.
- 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 세포 현탁액에서 비부착성 세포를 모으고 실온에서 45분 동안 rat-PDGFRα 항체 코팅 플레이트에서 배양합니다.
- rat-PDGFRα 항체 코팅된 플레이트에서 세포 현탁액을 배양한 후 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 세포 현탁액을 수집하고 플레이트를 DPBS로 8회 헹궈 비부착성 세포를 제거합니다. 플레이트의 측벽을 따라 세척 용액을 부드럽게 추가하고 플레이트를 여러 번 교반하여 부착되지 않는 세포를 제거합니다.
- 37°C에서 10분 동안 4mL의 세포 박리 용액 처리를 사용하여 rat-PDGFRα 항체 코팅 플레이트에서 세포를 분리합니다.플레이트를 흔들어 부착 세포를 제거합니다.
- 실온에서 300 x g의 원심분리로 정제된 OPC를 수집하고, 2mL OPC 세포 배양 배지로 세포 펠릿을 현탁하고, 트리판 블루와 혈구계(5mL 페니실린-스트렙토마이신 용액(P/S), 5mL N2, 10mL B27을 포함하는 DMEM/F12 배지의 500mL 세포 배양 배지)를 사용하여 세포를 계수합니다. 5 μg/mL 인슐린, 0.1% BSA, 20 ng/mL bFGF 및 10 ng/mL PDGFRα).
- 면역판닝(immunopanning) 후 OPC의 순도 검증.
- 면역판닝 후 OPC의 농축을 평가하려면 제조업체의 지침에 따라 구아니듐 티오시아네이트 기반 추출과 함께 RNA 추출을 위해 정제된 OPC 중 일부를 사용합니다.
- 이전에 발표된 자료에 따라 해리된 뇌세포와 비교하여 정제된 OPC에서 PDGFRα 발현의 농축을 확인하기 위해 형광 녹색 염료 마스터 믹스를 사용하여 qRT-PCR을 수행합니다.
- 또한 이전에 발표된 물질과 같이 항-NG2 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(NG2) 항체로 면역 염색을 위해 일부 정제된 OPC를 Poly-D-Lysine 코팅된 24웰 플레이트에 시딩합니다.
2. High-Throughput Sequencing을 위한 Low-cell ChIP 준비 및 ChIP 라이브러리 구축
- 제조업체 지침의 자세한 표준 절차에 따라 시판되는 초음파 처리 시스템 및 시판되는 저셀 수 ChIP 키트(재료 표 참조)를 사용한 Olig2 저세포 ChIP 준비.
- 랫드에서 항-PDGFRα 항체 코팅 플레이트를 분리하고 트리판 블루와 혈구계로 세포 계수를 한 후 각 ChIP 반응에 대해 1mL OPC 세포 배양 배지에 20,000개의 정제된 OPC를 넣습니다.
- 27μL의 36.5% 포름알데히드를 첨가하여 실온에서 10분 동안 세포 현탁액을 고정합니다.
주의: 포름알데히드는 안전상의 이유로 화학 흄 후드에 사용해야 합니다.
- 실온에서 5분 동안 50μL 2.5M 글리신으로 DNA 단백질 가교를 중지합니다.
메모: 이 시점부터 모든 단계는 얼음 위 또는 4°C의 냉장실에서 수행해야 합니다.
- 가교 결합된 세포 펠릿을 프로테아제 억제제 칵테일을 넣은 얼음처럼 차가운 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS) 1mL로 세척하고 4°C에서 300 x g의 사전 냉각된 원심분리기로 세포를 펠릿화합니다.
- 세포 펠릿을 25μL 완전 용해 버퍼에 넣고 ice.
에서 5분 동안 용해합니다.
메모: 튜브를 교반하여 Lysis Buffer에서 세포를 현탁시킵니다.
- 프로테아제 억제제 칵테일을 함유한 75μL 얼음처럼 차가운 HBSS로 세포 용해물을 보충하고 30초 ON 및 30초 OFF 프로그램의 5주기로 사전 냉각된 초음파 처리 시스템으로 세포 용해물의 염색질을 전단합니다. 항상 6개의 튜브를 함께 초음파 처리하고 밸런스 튜브에 100μL의 물이 들어 있는지 확인하십시오.
- 전단 후 14,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 원심분리 후 새 튜브에 상층액을 수집합니다.
- 100μL의 전단 염색질을 프로테아제 억제제로 동일한 부피의 얼음처럼 차가운 완전 ChIP 버퍼로 희석합니다.
- 희석된 전단 염색질 20 μL를 입력 제어 샘플로 저장합니다.
메모: Olig2 항체 면역침전된 DNA를 식별하기 위해 Olig2 면역침전된 샘플과 비교하기 위해 입력 제어 샘플도 필요합니다.
- 180μL의 희석된 전단 염색질에 rabbit anti-olig2 항체 1μL를 추가하고 40rpm으로 4°C에서 16시간 동안 회전하는 바퀴에 반응관을 배양합니다.
메모: 추운 방에서 이 단계를 수행하십시오.
- 각 ChIP 반응에 대해 11μL 자성 단백질 A 코팅 비드를 55μL 비드 세척 버퍼로 세척하고 비드 펠릿을 2회 세척 후 11μL의 비드 세척 버퍼에 넣습니다.
메모: 추운 방에서 이 단계를 수행하십시오.
- 각 ChIP 반응에 대해 사전 세척된 단백질 A 코팅 비드 10μL를 ChIP 반응 튜브에 추가합니다. 추운 방에서 이 단계를 수행하십시오.
- ChIP 반응 튜브를 4°C에서 회전 휠에서 2시간 더 배양합니다.
- ChIP 반응 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 놓습니다.
메모: 추운 방에서 이 단계를 수행하십시오.
- 상층액을 제거하고 비드 펠릿을 제거하지 마십시오.
- 4°C의 회전 휠에서 4분 동안 4개의 세척 버퍼 각각에 대해 100μL로 비드 펠릿을
세척합니다.
- 세척 후 비드 펠릿에 200μL의 용리 완충액을 추가하고 ChIP 반응 튜브를 65°C에서 4시간 동안 배양하여 가교 단백질-DNA를 역으로 배양합니다.
- 또한 20μL 입력 대조군 샘플에 180μL의 용리 완충액을 추가하고 65°C에서 4시간 동안 배양하여 가교 단백질-DNA도 역배양합니다.
- 각 ChIP 반응 튜브에 페놀, 클로로포름 및 이소아밀 알코올의 200μL 25:24:1(v/v) 혼합물을 추가합니다.
- 실온에서 1분 동안 격렬하게 소용돌이치고 13,000 x g에서 15분 동안 원심분리기를 합니다. 상상을 새 튜브로 옮깁니다.
- -20°C에서 하룻밤 동안 각 ChIP 반응 튜브에 파란색 염료에 공유 결합된 40μL 3M 아세트산 나트륨 용액 40μL, 100% 에탄올 1,000μL 및 2μL의 글리코겐 침전제를 추가합니다.
- 13,000 x g에서 4°C에서 20분간 원심분리기.
- 상층액을 버리고 500μL의 차가운 70% 에탄올로 세척한 후 13,000 x g에서 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다.
- 상등액을 버리고 펠릿을 10분 동안 건조한 상태로 유지하고 펠릿을 50μL의 물로 용해시킵니다.
- 고처리량 염기서열분석을 위한 ChIP 라이브러리 구축
- 제조업체의 지침에 따라 청소 키트로 ChIP DNA를 청소하고 농축합니다.
- ChIP 샘플을 정량화하십시오.amp제조업체의 지침에 따라 피코 그린으로 le.
- T-tailing, 복제 및 테일링, 템플릿 전환 및 확장, 어댑터 추가 및 증폭, 라이브러리 크기 선택 및 제조업체의 지침에 따른 정제를 위해 ChIP-seq 키트를 사용합니다.
- dsDNA의 변성 후, 새우 알칼리성 인산가수분해효소에 의해 ssDNA의 3' 말단을 탈인산화하고 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소에 의해 ssDNA에 폴리(T) 꼬리를 추가합니다.
- DNA 복제 및 템플릿 전환을 위해 DNA Poly(dA) Primer를 ssDNA 템플릿에 어닐링합니다.
- 템플릿 전환 후 인덱싱을 위한 정방향 및 역방향 프라이머와 함께 PCR로 ChIP-seq 라이브러리를 증폭합니다.
- 더블 사이즈 선택을 위해 옵션 2에 의해 상자성 비드에 의해 250 - 500 bp 범위의 단편이 있는 PCR 증폭 ChIP-seq 라이브러리를 선택하십시오.
- 미세유체 칩-모세관 전기영동 장치를 사용하여 선택한 ChIP-seq 라이브러리의 품질을 검사합니다.
