1. 편광 현미경
- 광시야 레이저 조명의 경우, 빔 클린업을 위해 연속 다이오드 레이저(40mW)의 638nm 라인을 다중 모드 광섬유의 조리개에 초점을 맞춥니다. 광섬유의 출력에 선형 편광판을 장착하여 레이저 광의 편광을 설정합니다.
- 이색성 미러(640nm cut-off)와 대역통과 필터(bandpass 700/75)로 방출된 빛의 excitation component를 차단합니다.
- 형광 신호가 편광 빔 스플리터를 통과하도록 하면 방출된 빛을 수직 및 평행 편광 구성 요소로 분할합니다. 그런 다음 이면조사형 EM-CCD 카메라의 칩에 200mm 초점 거리의 무채색 렌즈를 사용하여 반사되지 않은 빔(평행 구성 요소)과 반사된 빔(수직 구성 요소)의 초점을 맞춥니다(그림 1b 및 1c). 거울을 사용하여 렌즈를 향하는 수직 빔의 방향을 조정합니다.
2. 형광 표지 참조 DNA 올리고머의 설계 및 테스트
- reference DNA의 핵심 염기서열 결정: 이 방법은 transcription factor와 TF에 대한 친화력이 reference (KD1)로 작용하는 형광 표지 DNA와 결합하기 위해 경쟁하는 unlabeled competitor DNA oligomer 사이의 해리 상수(KD2)를 측정하는 경쟁 분석을 기반으로 합니다. DNase 발자국 또는 박테리아 1-하이브리드와 같은 다른 출처에서 얻은 합의 서열이 시작점이 될 수 있습니다.
메모: 일반적으로 적절한 reference DNA는 합의 염기서열에 비해 TF에 대한 결합 친화도가 3-7배 감소합니다.
- 이전 단계에서 도출된 합의 서열의 2-3개의 임시 단일 돌연변이의 KD1을 HiP-FA로 측정합니다. 바인딩의 완전한 손실을 피하기 위해 너무 구체적이지 않은 합의 시퀀스의 위치를 변경해 보십시오.
메모: 참조 염기서열은 관심 있는 전사 인자(이 프로토콜 Giant Gt에서 사용)에 의해 결합되는 것이 중요하지만 너무 강하지 않아야 약한 경쟁자가 높은 농도에서 이를 능가할 수 있습니다.
- 양쪽에 대칭적으로 측면 시퀀스를 추가하여 핵심 모티프(일반적으로 8-12개의 염기 쌍)를 16개 이상의 염기 쌍 길이로 확장합니다(적절한 바인딩을 위해 측면 사슬 추가). 필요한 경우(예: 더 긴 결합 도메인의 경우) 더 긴 염기서열을 사용합니다(HiP-FA 분석으로 최대 ~50개의 염기쌍 길이가 테스트됨).
주의: 이소성 결합 부위를 생성할 것으로 예상되는 염기를 추가하지 않도록 주의하십시오. 이 프로세스를 용이하게 하기 위해 사용 가능한 PWM에서 바인딩 사이트를 예측하는 계산 도구(예: PySite)를 사용합니다.
- 표지된 참조 DNA로서, 3' 또는 5' 말단의 정방향 또는 역방향 가닥에 형광 표지된 올리고머를 주문합니다. 예를 들어, Cy5, Bodipy-650 또는 기타 적절한 염료를 물 중 10μM(100μM 10x 스톡) 농도로 사용하고 3.1단계에 설명된 대로 단계적으로 희석합니다.
- 증류수에 33mM 인산칼륨 완충액(pH = 7.0), 90mM NaCl 및 0.01% 비이온 세제를 첨가하여 500mL의 1x 결합 완충액을 준비합니다. 또한 3배 농도를 제외하고 동일한 성분을 포함하는 3x 결합 완충액을 준비합니다. 3x 결합 완충액을 1x 결합 완충액의 원액으로 사용하는 경우 500mL> 부피를 준비합니다. 그렇지 않으면 250mL를 준비합니다.
메모: 이 조성은 전사 인자 안정성과 글루타티온 S-전이효소(GST) 이합체화를 방지하기 위해 최적화되었습니다.
- 1단계에서 설명한 현미경 설정으로 유리 바닥 현미경 검사 96웰 플레이트(TF 농도가 다른 5-6웰)에 다양한 양의 TF가 존재하는 상태에서 0.8nM 표지 참조 DNA를 포함하는 200μL의 결합 완충액의 FA를 측정하여 사용할 TF 농도를 결정합니다. TF의 양이 증가함에 따라 적정 시리즈를 수행하고 분석을 위해 곡선이 고원에 도달하는 농도를 선택하여 DNA reference oligomer의 완전한 결합을 나타냅니다.
메모: 최적의 TF 농도는 TF-DNA 해리 상수의 값에 따라 달라집니다. 일반적으로 KDs가 낮을수록 농도가 낮아집니다.
3. 올리고머 어닐링
- 표지된 참조 DNA(이전 단계에서 결정된 염기서열)의 DNA 올리고머를 어닐링하려면 10mM 염료 표지된 전방 단일 가닥 DNA 용액 7μL와 10mM 농도의 표지되지 않은 역보체 7μL를 186μL의 물에 혼합합니다.
- 경쟁사 DNA 염기서열의 경우, 측정할 각 개별 경쟁사 염기서열에 대해 20μL의 100mM 용액(제조업체에서 제공한 물)과 20μL의 해당 역 단일 가닥 DNA 100mL를 혼합합니다.
- 용액을 3분 동안 70°C로 가열하고 온도를 0.1K/s의 속도로 RT로 낮추어 표준 PCR cycler에서 별도로 어닐링을 수행합니다. 사용된 PCR 기계가 해당 속도에서 온도 구배를 지원하지 않는 경우 온도가 감소하는 상태에서 단계적 배양을 수행하기만 하면 됩니다(테스트는 사이클당 -0.4K로 3초의 99사이클로 수행됨).
4. 젤 준비
참고: 다음 섹션에서는 두 가지 다른 종류의 겔의 제조를 설명합니다: 1) 적정 웰은 단백질이 있는 겔을 포함하고 각 경쟁사 DNA 염기서열에 대한 KDs를 결정하는 데 사용되며, 2) 보정 웰은 NB를 사용하여 주어진 모든 시점 및 획득 높이에서 DNA 농도를 결정합니다. 초점은 96웰 플레이트에서 실험을 준비하는 데 있지만 384웰 플레이트 형식에 해당하는 부피도 표시됩니다.
- 0.5% w/v 저융점 아가로스를 실험실 전자레인지에서 끓여서 결합 완충액에 녹입니다. 완전한 용해 후 증발 가능성을 보상하기 위해 ddH2O로 부피를 다시 조정하십시오.
메모: 편의상 10-20 10mL 분취액을 준비하고 필요할 때 75°C에서 녹입니다. 겔 스톡은 RT.
에 보관할 수 있습니다.
주의: 전자레인지에서 젤 용액이 과열되지 않도록 주의하세요. 중간에 흔들림이 있는 짧은 가열 시간 간격이 바람직합니다.
- 적정 및 검량 웰을 준비하려면 먼저 2개의 10mL 겔 스톡 부분 표본을 75°C에서 진탕 하에서 용융합니다.
- 각 경쟁업체에 대해 240μL(20% 오버헤드 포함)를 사용합니다(n = 경쟁업체 염기서열 수).
- 두 젤의 동일한 온도 그리고 점성을 지키기 위하여 NB 구경측정 우물을 위해 젤의 동일한 양을 이용하십시오.
- 그런 다음 온도를 35°C로 설정하고 온도가 평형을 이룰 때까지 기다립니다.
- 적정 웰의 경우, 1.4 nM (최종 농도) 혼성화 참조 DNA(3단계에서 수득), TF 단백질(최종 농도 CTF = 20-60 nM, 단계 2.6에서 결정), DTT(0.2 mM) 및 결합 완충액을 96 또는 384 웰 플레이트 형식으로 n x 200 μL 또는 n x 13 μL의 총 부피에 추가합니다. 각각(오버헤드 포함). 반전/흔들기(와류하지 않음)로 철저히 혼합하십시오.
- 이전 단계에서 준비한 겔 용액의 96웰 플레이트 형식(386웰의 경우 13μL/웰)으로 웰당 200μL를 웰 플레이트의 적정 웰에 천천히 추가합니다.
- 검량 웰의 경우, 먼저 웰 외부의 용융된 겔에 5nM NB를 추가합니다(총 부피는 사용된 웰 플레이트 형식 및 교정 웰 수에 따라 다름, 일반적으로 웰 플레이트당 5-6개로 충분함).
- NB 함유 겔 200 μL(384웰 플레이트 형식의 경우 13 μL)를 웰 플레이트의 적정 웰 내에서 천천히 피펫으로 만들고 기포를 피해야 합니다.
메모: 전자 피펫 또는 로봇 공학을 사용하면 재현성이 크게 향상됩니다.
- 젤이 RT에서 10분 동안 굳어지도록 하고 10°C에서 4분 더 굳히십시오(필요한 경우 나중에 유리에서 응결을 제거하십시오). 불균일한 겔 표면을 피하기 위해 완벽하게 수평인 표면에서 이 모든 단계를 수행해야 합니다.
메모: 젤을 포함하는 단백질은 보통 4개의 °C에 적어도 몇 시간 동안 안정되어 있습니다.
5. 경쟁사 DNA 솔루션 추가
참고: 다음 용액은 적정을 시작하기 전에 준비해야 하며 교정 및 적정 웰 위에 동시에 추가해야 합니다.
- 어닐링된 표지된 reference DNA와 단백질을 겔 스톡 분취량보다 3배 더 높은 농도의 3x 결합 완충액에 추가합니다.
- 얻어진 용액 20 μL를 단계 3에서 얻은 각 어닐링된 경쟁사 DNA 용액 40 μL와 혼합합니다.
- 각 검량 웰에 대해 15mM NB 용액을 포함하는 20μL의 3x 결합 완충액을 40μL의 어닐링된 경쟁사 DNA와 혼합합니다(동일한 길이의 모든 염기서열이 적합함).
메모: 384웰 플레이트의 경우 총 60μL 대신 21μL를 사용합니다.
- 선택적으로, multi-well plate reader를 사용하여 380nm에서 흡광도를 측정하여 플레이트의 다른 wells에서 gel height level의 균질성을 spectroscopically로 확인합니다(흡광도 값은 gel 높이에 비례함).
- 겔 위에 50 μL(384웰 플레이트 형식의 경우 7 μL)의 혼합 경쟁사 DNA 용액(3단계에서 어닐링)을 추가합니다. 가능한 경우 전동 멀티채널 파이펫 또는 96채널 파이펫팅 헤드를 사용하여 모든 경쟁사 솔루션을 가능한 한 동시에 추가하십시오. 경쟁사 솔루션을 추가한 후 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고 즉시 측정을 시작합니다.
6. 이미지 획득
- z-stack의 시계열을 순차적으로 획득합니다(예: 12개의 평면 및 100-300ms의 조명 시간 사용). 편광 편향을 배제하기 위해 웰 표면(여기에 사용된 플레이트의 경우 < ~1.4μm)에 너무 가깝게 이미지를 촬영하지 마십시오.
- TF에서 라벨링된 참조 DNA의 결합이 완전히 해제될 때까지 10-25 사이클의 측정을 수행합니다. 종말점은 일반적으로 1-2시간 후에 도달하며, 이는 경쟁사 DNA의 결합 역학 및 확산도에 따라 달라집니다.
