Transcription Factor-DNA Binding Affinity를 결정하기 위한 형광 이방성

초록

출처: Jung, C. et al., 형광 현미경을 사용한 경쟁적 적정에 의한 전사 인자-DNA 결합 친화도의 고감도 측정. J. Vis. 특급. (2019).

이 비디오는 전사 인자와 DNA 간의 상호 작용을 모니터링하는 데 도움이 되는 고성능 형광 이방성에 대해 설명합니다. 이 분석은 형광단으로 표지된 DNA의 분자 회전 또는 이방성으로 인한 편광 정도를 측정하여 형광단으로 표지된 DNA 분자와 특정 전사 인자의 상호 작용을 모니터링합니다.

프로토콜

1. 편광 현미경

1. 광시야 레이저 조명의 경우, 빔 클린업을 위해 연속 다이오드 레이저(40mW)의 638nm 라인을 다중 모드 광섬유의 조리개에 초점을 맞춥니다. 광섬유의 출력에 선형 편광판을 장착하여 레이저 광의 편광을 설정합니다.
2. 이색성 미러(640nm cut-off)와 대역통과 필터(bandpass 700/75)로 방출된 빛의 excitation component를 차단합니다.
3. 형광 신호가 편광 빔 스플리터를 통과하도록 하면 방출된 빛을 수직 및 평행 편광 구성 요소로 분할합니다. 그런 다음 이면조사형 EM-CCD 카메라의 칩에 200mm 초점 거리의 무채색 렌즈를 사용하여 반사되지 않은 빔(평행 구성 요소)과 반사된 빔(수직 구성 요소)의 초점을 맞춥니다(그림 1b 및 1c). 거울을 사용하여 렌즈를 향하는 수직 빔의 방향을 조정합니다.

2. 형광 표지 참조 DNA 올리고머의 설계 및 테스트

1. reference DNA의 핵심 염기서열 결정: 이 방법은 transcription factor와 TF에 대한 친화력이 reference (K_D1

결과

그림 1: HIP-FA 분석 및 실험 설정의 개략도.(a) 단일 웰에서 경쟁사 DNA를 적정하기 위한 겔 전달 시스템. (b) HIP-FA 현미경 설정. EM-CCD 카메라에서 편광 형광을 감지하는 맞춤형 자동 광시야 현미경. (c) 평행(빨간색) 및 수직(녹색) 편광 구성 요소를 결정하는 데 사용되는 두 개의 관심 영역이 있는 원시 형광 이미지. (d) 96웰 플레이트의 일반적인 레이아웃.

....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Cy5 라벨 16-/18-bp DNA-올리고머	유로핀		사용자 지정 합성
16- / 18-bp DNA-올리고머	유로핀		사용자 지정 합성
나일 블루 A	시그마	N5632-25G
Sensoplate plus microplate 96 또는 384웰, PS	그라이너	655891
384웰 센소플레이트, 검정색	그라이너	788896
아가로스, 낮은 겔화 온도	시그마	A9414-50G
소금	머 크	1.06404.1000
트윈-20	시그마	P1379-1L
Di-Potassium 수소 인산염 삼수화물	머 크	1.05099.1000
인산이수소칼	머 크	1.04873.1000
Q-POD 요소	머크 밀리포어	ZMQSP0DE1
Millipak 40 감마 골드 필터	머크 밀리포어	MPGL04GK2
Milli-Q Integral 3 정수 시스템	머크 밀리포어	ZRXQ003WW
퀀텀 TIX	머크 밀리포어	QTUMOTIX1
DL-디티오트레이톨	시그마	43815-1지
Mastercycler 그라디언트	에펜도르프	Z316083
SafeSeal 튜브 1.5 mL	사르슈테트	72.706.200
튜브 15 mL	사르슈테트	62.554.502
곱하기 프로 컵 0.2 mL PP	사르슈테트	72.737.002
현미경 설정:
자동 광시야 현미경	라이카	DMI6000
장거리 목표	라이카	HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. 건조
638nm 라인 연속 다이오드 레이저	오미크론	펙스 638-40, 40mW
이면조사형 EM-CCD 카메라	안도르	아이슨 DV897
다이크로익 미러	아에프	640nm 컷오프
대역통과 필터	아에프	ET 대역 통과 700/75
선형 편광판	쏘랩스	LPVISC050-MP2
편광 빔 스플리터	쏘랩스	학사010
무채색 렌즈	쏘랩스	200mm 초점 거리
다중 모드 광섬유	옵트로니스	FVP600660710
로봇 시스템:
당사의 로봇 시스템에는 모든 액체 이송 단계에 사용되는 서보 셔틀과 연결된 96채널 헤드가 있는 Biomek NXP 워크스테이션과 Span-8 피펫터가 포함되어 있습니다. 또한 이 시스템에는 오비탈 셰이커와 Span-8 그리퍼가 제공하는 마이크로플레이트 리더(Paradigm, Molecular device)가 장착되어	벡크만 쿨터	바이오멕 NXP
소프트웨어:
프로그래밍 언어	내쇼날인스트루먼트	랩뷰 9.0
HiP-FA 소프트웨어용 스크립트는 다음에서 사용할 수 있습니다.			https://github.com/ GeneCenter뮌헨/HiP-FA

륨 있습니다