표적 유전자의 번역 조절을 연구하기 위한 Reporter Gene Repression Assay

초록

출처: Katz, N., et al. 박테리아의 단백질-RNA 결합을 정량화하기 위한 분석. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 RNA 결합 단백질(RBP)과 RNA의 상호 작용을 연구하기 위한 박테리아의 생체 내 분석을 보여줍니다. 박테리아 세포는 두 개의 플라스미드 구조(RBP 결합 부위의 다운스트림에 있는 형광 리포터 유전자를 포함하는 mRNA를 인코딩하는 결합 부위 플라스미드)로 형질전환되는 반면, RBP 플라스미드는 유도체의 제어 하에 RBP 단백질을 발현합니다. RBP 생산의 유도자 매개 증가에 따라 RBP는 mRNA에 결합하여 리보솜 결합 억제를 통해 리포터의 번역 억제를 초래합니다.

프로토콜

1. 시스템 준비

1. 결합 부위 플라스미드의 설계
   1. 그림 1과 같이 바인딩 부위 카세트를 설계합니다. 각 minigene은 다음과 같은 부분 (5' 내지 3')을 포함합니다: Eagl 제한 부위, kanamycin (Kan) 저항성 유전자의 5' 말단의 ∼40 염기, pLac-Ara 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS), mCherry 유전자의 AUG, 스페이서 (δ), RBP 결합 부위, mCherry 유전자의 5' 말단의 80 염기, 및 ApaLI 제한 사이트.
      메모: 분석의 성공률을 높이려면 각 결합 부위에 대해 3개의 결합 부위 카세트를 설계하고 스페이서는 적어도 1개, 2개 및 3개의 염기로 구성됩니다. 자세한 지침은 Representative Results 섹션을 참조하십시오.
2. 결합 부위 플라스미드의 클로닝
   1. 결합 부위 카세트를 double-stranded DNA(dsDNA) 미니유전자로 주문합니다. 각 minigene은 길이가 ∼500 bp이며 각각 5' 및 3' 말단에 Eagl 제한 부위와 ApaLI 제한 부위를 포함합니다(1.1.1 단계 참조).
      메모: 이 실험에서는 카나마이신 유전자의 절반을 가진 미니 유전자에 양성 콜로니에 대한 스크리닝을 용이하게 하도록 명령했습니다. 그러나, 깁슨(Gibson) 어셈블리도 여기에 적합하며, 이 경우 결합 부위는 두 개의 더 짧은 상보적 단일 가닥 DNA 올리고로 정렬될 수 있습니다.
   2. 제한 프로토콜에 따라 Eagl-HF 및 ApaLI로 미니 유전자와 타겟 벡터를 모두 이중 분해하고 컬럼 정제합니다.
   3. 소화된 minigenes를 mCherry reporter gene, terminator 및 kanamycin resistance gene의 나머지 부분을 포함하는 결합 부위 backbone에 접합합니다.
   4. 결찰 용액을 대장균 TOP10 세포로 변환합니다.
   5. Sanger 염기서열분석을 통해 양성 형질전환체를 식별합니다.
      1. 관심 영역의 업스트림에 primer 100 염기를 설계합니다(primer sequences는 표 1 참조).
      2. 몇 가지 박테리아 군체를 Miniprep하십시오.
      3. 5 μL의 프라이머 용액 5 μL와 DNA 10 μL를 80 ng/μL 농도로 준비합니다.
      4. 두 가지 솔루션을 Sanger 염기서열분석을 위한 편리한 시설로 보내십시오.
   6. 정제된 플라스미드는 -20°C에서 보관하고 박테리아 균주는 글리세롤 스톡으로 둘 다 96웰 형식으로 보관합니다. 그런 다음 DNA를 사용하여 4개의 융합-RBP 플라스미드 중 하나를 포함하는 E. coli TOP10 세포로 형질전환시킵니다(1.3.5단계 참조).
3. RBP plasmid
   의 설계 및 시공 참고: 이 연구에 사용된 외투 단백질의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 표 2에 나열되어 있습니다.
   말단에
   1. 제한 부위가 있는 정지 코돈이 없는 맞춤형 정렬된 dsDNA minigene으로 정지 코돈이 없는 필요한 RBP 염기서열을 정렬합니다(그림 1).
   2. 1.2.2-1.2.4단계와 유사하게, 유도성 프로모터의 바로 다운스트림과 시작 코돈이 없는 형광 단백질의 업스트림에서 정지 코돈이 없는 테스트된 RBP를 클로닝합니다(그림 1). RBP 플라스미드가 결합 부위 플라스미드와 다른 항생제 내성 유전자를 함유하고 있는지 확인합니다.
   3. 1.2.5단계와 유사한 Sanger 염기서열분석을 통해 positive transformant를 식별합니다(primer 염기서열분석은 표 1 참조).
   4. 하나의 양성 형질전환체를 선택하여 화학적으로 유능하게 만드십시오. 글리세롤 정제 플라스미드는 -20°C에서, 박테리아 균주의 글리세롤 스톡은 -80°C에서 96웰 플레이트에 보관합니다.
   5. 96-well plate에 저장된 결합 부위 플라스미드(step 1.2.6)를 이미 RBP-mCerulean plasmid를 함유하고 있는 화학적 적질의 박테리아 세포로 형질전환시킵니다. 시간을 절약하려면 페트리 접시에 세포를 도금하는 대신 관련 항생제(Kan 및 Amp)와 함께 Luria-Bertani(LB) 한천이 포함된 8레인 플레이트에 8채널 피펫터를 사용하여 플레이트를 만듭니다. 식민지는 16시간 후에 나타나야 합니다.
   6. 각 이중 형질전환체에 대해 단일 콜로니를 선택하고 관련 항생제(Kan 및 Amp)와 함께 LB 배지에서 하룻밤 동안 성장시키고 96-웰 플레이트에서 -80°C에서 글리세롤 스톡으로 저장합니다.

2. 실험 설정

참고: 여기에 제시된 프로토콜은 인큐베이터 및 플레이트 리더와 함께 액체 취급 로봇 시스템을 사용하여 수행되었습니다. 각 측정은 24개의 유도 물질 농도에 대해 수행되었으며 각 균주 + 유도 물질 조합에 대해 2개의 중복이 있었습니다. 이 로봇 시스템을 사용하여 24개의 유도 물질 농도와 함께 하루에 16개의 균주에 대한 데이터를 수집했습니다. 그러나 이러한 장치를 사용할 수 없거나 더 적은 수의 실험이 필요한 경우 8채널 멀티 피펫을 사용하여 수동으로 쉽게 수행하고 그에 따라 프로토콜을 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 12개의 유도제 농도와 4개의 시점을 가진 하루에 4개의 균주에 대한 예비 결과가 이러한 방식으로 획득되었습니다.

1. 트립톤 0.5g, 글리세롤 0.3mL, NaCl 5.8g, 1M MgSO₄ 50mL, pH 7.4 10x 인산염 완충 식염수(PBS) 완충액 1mL 및 이중 증류수(DDW) 950mL를 혼합하여 1L의 생물학적 분석 완충액(BA)을 미리 준비합니다. 오토클레이브 또는 멸균 필터는 BA 버퍼를 필터링합니다.
2. 적절한 항생제(최종 농도 25μg/mL의 카나마이신 및 최종 농도 100μg/mL의 암피실린)와 함께 1.5mL LB에서 37°C 및 250rpm 쉐이킹에서 이중 형질전환체 균주를 18시간(밤새) 동안 48웰 플레이트에서 성장시킵니다.
3. 아침에는 다음과 같은 준비를 합니다.
   1. 인듀서 플레이트. 깨끗한 96웰 플레이트에 37°C의 인큐베이터에서 95% BA와 5% LB26으로 구성된 SPM(semi-poor medium)이 있는 웰을 준비합니다. 웰의 수는 원하는 유도 물질 농도의 수에 해당합니다. 가장 높은 유도 농도(218nM)를 포함하는 인듀서 플레이트의 웰에 C4-HSL을 추가합니다.
   2. 가장 높은 농도의 각 웰에서 0에서 218 nM 범위의 23개의 낮은 농도로 연속적으로 희석되도록 로봇을 프로그래밍합니다. 각 유도제 희석액의 부피는 모든 균주(중복 포함)에 충분해야 합니다.
   3. 유도제 희석액을 준비하는 동안 37°C의 인큐베이터에서 96웰 플레이트에 180μL의 SPM을 가열합니다.
   4. 2.2 단계의 야간 균주를 연속 희석으로 100 배 희석 : 먼저, 48 웰 플레이트에서 100 μL의 박테리아와 900 μL의 SPM을 혼합하여 10 배로 희석 한 다음 희석 된 용액에서 20 μL를 180 μL의 예열 된 SPM으로 취하여 다시 10 배로 희석합니다. 형광 측정에 적합한 96웰 플레이트에 있습니다.
   5. 유도 플레이트의 희석된 유도제를 최종 농도에 따라 희석된 균주가 있는 96웰 플레이트에 추가합니다.
4. 30분마다 플레이트 리더를 통해 595nm(OD595), mCherry(560nm/612nm) 및 mCerulean(460nm/510nm) 형광에서 광학 밀도를 측정하면서 37°C에서 96웰 플레이트를 6시간 동안 흔듭니다. 정규화를 위해 셀이 추가되지 않은 SMP의 성장을 측정합니다.

결과

그림 1: 시스템 설계 및 복제 단계 개요. 결합 부위 플라스미드(왼쪽)와 RBP-mCerulean 플라스미드(오른쪽)에 대한 카세트 디자인 그림. 다음 단계는 RBP 플라스미드를 먼저 사용하여 두 플라스미드를 모두 수용성 대장균 세포로 연속적으로 형질전환시키는 것입니다. 그런 다음 이중 형질전환체는 증가하는 유도 물질 농도에서 mCherry 발현 수준에 대해 테스트됩니다. RBP가 결합 부위에 결합하면 mCerulean(회색 거품)의 기능으로 mCherry 수치가 감소합니다.

표 1: 결합 부위 및 염기서열분석 프라이머. 이 연구에 사용된 결합 부위 및 결합 부위 카세트에 대한 염기서열과 프로토콜에 자세히 설명된 염기서열분석 반응에 대한 프라이머(단계 1.2....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
암피실린 나트륨 염	시그마	A9518
황산마그네슘(MgSO4)	알파 에자르	33337
48 플레이트	액시겐	P-5ML-48-C-S
8레인 플레이트	액시겐	RESMW8I
96웰 플레이트	액시겐	P-DW-20-C
플레이트 리더용 96웰 플레이트	퍼킨 엘머	6005029
아팔리	넵	R0507
부위 염기서열 바인딩	Gen9 Inc.와 Twist Bioscience		표 1 참조
대장균 TOP10 세포	인비트로젠	C404006
이글-HF	넵	R3505
글리세롤	바이오 랩	71205
부 화기	테칸	Liconic 인큐베이터
카나마이신 솔페이트	시그마	K4000
KpnI- HF	넵	R0142
리가아제	넵	B0202S
액체 취급 로봇 시스템	테칸	EVO 100, MCA 96채널
MATLAB 분석 소프트웨어	매스웍스
멀티 피펫 8	액시겐	BR703710
N-부타노일-L-호모세린락톤(C4-HSL)	케이맨	K40982552 019
PBS 버퍼	생물 산업	020235ᅡ
플레이트 리더	테칸	인피니트 F200 프로
Q5 핫스타트 중합효소	넵	M0493
RBP 염기서열	애드진	27121 & 40650	표 2 참조
염화나트륨(NaCl)	바이오 랩	190305
SV Gel 및 PCR 클린업 시스템	프로메가	A9281
트립톤	BD (영어)	211705

레인