이질체 단백질 복합체-DNA 상호작용을 검출하기 위한 Modified Yeast-One 하이브리드 분석

초록

출처: Tripathi, P. et al., 이질체 단백질 복합체-DNA 상호 작용 연구를 위한 변형된 효모-원 하이브리드 시스템. J. Vis. 특급. (2017년)

이 비디오에서는 표적 DNA와 상호 작용하는 여러 단백질을 검출하는 변형된 효모 단일 하이브리드 분석을 시연합니다. 형질전환된 효모 세포는 리포터 유전자의 상류에 있는 표적 DNA 염기서열을 포함합니다. 또한, 그들은 전사 인자 단백질을 발현합니다. 단백질이 복합체를 형성하고 표적 DNA에 결합할 때 리포터 유전자가 발현되고 효소로 검출될 수 있습니다.

프로토콜

1. 9일차(오전): 효소 측정을 위한 배양을 시작합니다.

1. 분광광도계 플레이트에서 멀티채널 피펫을 사용하여 배양을 다시 현탁하고 125μL를 전송합니다(OD₆₀₀ 측정).
   메모: 주의: 기포를 피하기 위해 마지막 한 방울을 분주하지 말고, OD₆₀₀이 0.3 - 0.6 미만인 경우 판독값에 따라 나머지 세포를 1 - 2시간 더 배양합니다. 이 단계에서 사용된 125μL 배양액은 사용자의 재량에 따라 폐기하거나 원래의 딥 웰 블록으로 다시 옮길 수 있습니다.
2. 딥 웰 블록의 나머지 세포를 3000 x g 및 21°C에서 10분 동안 원심분리합니다.반전으로 상층액을 제거합니다.
3. 200μL의 Z-버퍼와 vortex.
   추가 메모: 표 1의 Z-buffer 레시피를 참조하십시오.
4. 3000 x g 및 21 °C에서 5분 동안 원심분리기. 반전으로 상층액을 제거합니다.
5. 20μL Z-버퍼와 볼텍스를 추가합니다.
6. 동결-해동 주기에 견딜 수 있는 밀봉 호일로 플레이트를 덮습니다. 흄 후드....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96웰 라운드 바닥 플레이트	그라이너 바이오 원	650101	플라스틱 도자기
96-딥 웰 블록	미국 과학	1896-2000	플라스틱 도자기
밀봉 가능한 호일	미국 과학	2923-0110	플라스틱 도자기
아라실	엑셀 사이언티픽	나-100	플라스틱 도자기
2-메르캅토에탄올	피셔 사이언티픽	제034461-100	시험
온페이지	시그마-알드리치	73660	시험
나2CO3	시그마-알드리치	223484	시험
나2HPO4	시그마-알드리치	S3264 (영어	시험
나H2PO4	시그마-알드리치	S3139 (영어	시험
케이클	피셔 사이언티픽	BP366-500	시험
재질 보기 MgSO4	시그마-알드리치	83266	시험
염산(HCl)	피셔 사이언티픽	SA54-4	시험
드라이 배스	써모 피셔		장치
소용돌이	써모 피셔		장치
원심 분리기	에펜도르프	원심분리기 5810R	장치
플레이트 리더	분자 장치	SPECTRAMAX PLUS Microplate 분광 광도계	장치
부 화기	써모 피셔	모형: 5250-37 Degree, 6250-30 degrees	장치
셰이커 인큐베이터	뉴 브런즈윅		장치
수조	써모 피셔	아이소온도 205	장치
트리스 베이스	피셔 사이언티픽	BP152-1	시험

년 년 호 년 ) ) (영문)