이질체 단백질 복합체-DNA 상호작용을 검출하기 위한 Modified Yeast-One 하이브리드 분석

초록

출처: Tripathi, P. et al., 이질체 단백질 복합체-DNA 상호 작용 연구를 위한 변형된 효모-원 하이브리드 시스템. J. Vis. 특급. (2017년)

이 비디오에서는 표적 DNA와 상호 작용하는 여러 단백질을 검출하는 변형된 효모 단일 하이브리드 분석을 시연합니다. 형질전환된 효모 세포는 리포터 유전자의 상류에 있는 표적 DNA 염기서열을 포함합니다. 또한, 그들은 전사 인자 단백질을 발현합니다. 단백질이 복합체를 형성하고 표적 DNA에 결합할 때 리포터 유전자가 발현되고 효소로 검출될 수 있습니다.

프로토콜

1. 9일차(오전): 효소 측정을 위한 배양을 시작합니다.

1. 분광광도계 플레이트에서 멀티채널 피펫을 사용하여 배양을 다시 현탁하고 125μL를 전송합니다(OD₆₀₀ 측정).
   메모: 주의: 기포를 피하기 위해 마지막 한 방울을 분주하지 말고, OD₆₀₀이 0.3 - 0.6 미만인 경우 판독값에 따라 나머지 세포를 1 - 2시간 더 배양합니다. 이 단계에서 사용된 125μL 배양액은 사용자의 재량에 따라 폐기하거나 원래의 딥 웰 블록으로 다시 옮길 수 있습니다.
2. 딥 웰 블록의 나머지 세포를 3000 x g 및 21°C에서 10분 동안 원심분리합니다.반전으로 상층액을 제거합니다.
3. 200μL의 Z-버퍼와 vortex.
   추가 메모: 표 1의 Z-buffer 레시피를 참조하십시오.
4. 3000 x g 및 21 °C에서 5분 동안 원심분리기. 반전으로 상층액을 제거합니다.
5. 20μL Z-버퍼와 볼텍스를 추가합니다.
6. 동결-해동 주기에 견딜 수 있는 밀봉 호일로 플레이트를 덮습니다. 흄 후드에서 액체 질소를 사용하여 4주기의 동결/해동을 수행한 다음 수조에서 42ºC(각 2분)를 수행합니다.
7. 200 μL Z-buffer/beta-mercaptoethanol (β-ME)/Ortho-nitrophenyl-β-galactoside (ONPG) (12 mL, 21 μL, 8.4 mg 각각 20 mL 용액 생성, 항상 신선하게 준비)를 추가합니다.
   메모: ONPG가 제대로 용해되는 데 시간이 걸리므로 이 단계에 도달하기 한 시간 전에 솔루션을 준비하십시오. ONPG는 β-갈락토시다아제 활성을 측정하기 위한 기판 역할을 합니다.
8. 30 °C에서 최대 17 - 24 시간 동안 배양하십시오 (중간에 확인하십시오. 색이 더 일찍 발현되면 다음 단계로 진행하십시오).

2. 10일차(오전): 반응을 중지하고 측정합니다.

1. 110 μL 1M Na₂CO₃ 를 첨가하여 반응을 중지하고 시간을 기록합니다.
2. 3000 x g 및 21 °C에서 10분 동안 와류 및 원심분리기.
3. 멀티채널을 사용하여 125μL의 상등액을 취하고 OD₄₂₀.
   를 측정합니다. 메모: 주의, 거품을 피하기 위해 마지막 한 방울을 투여하지 마십시오.

표 1: 프로토콜에 사용된 용액의 레시피.이 표는 분석에 사용된 주요 완충액의 원액 및 작동 용액에 대한 레시피를 제공합니다.

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TE 버퍼 10X (10ml)
바람직한	재고에서
1000mM 트리스-Cl (산도 8.0)	트리스 1M 1mL
10mM EDTA (산도 8.0)	EDTA 0.5M의 200uL
물로 볼륨을 조절하십시오.
TE/LiAc(10ml)
바람직한	재고에서
1배	1mL TE 10X
0.1M 리튬 AC	1mL 리튬 이온 1M
물로 볼륨을 조절하십시오.
TE/LiAc/PEG(50mL) 50%
바람직한	재고에서
1배	5mL TE 10X
0.1M 리튬 AC	5mL 리튬 AC 1M
40 mL PEG3350
Z-버퍼(1L) pH 7.0
Na2HPO4 16.1g의 헵타하이드레이트 또는 8.52g의 무수
NaH2PO4 수화 5.5g 또는 무수 4g
KCl 0.75g
MgSO4 0.246g의 수화 또는 0.12g의 무수
HCl로 pH 유지
모든 솔루션은 사용 전에 sterlized됩니다.
프로토콜에 사용되는 미디어 및 한천 플레이트(YPDA, SD-Ura; SD-Trp-Ura 및 SD-Trp-Ura 한천 플레이트)는 Y1H와 동일한 레시피를 따릅니다

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96웰 라운드 바닥 플레이트	그라이너 바이오 원	650101	플라스틱 도자기
96-딥 웰 블록	미국 과학	1896-2000	플라스틱 도자기
밀봉 가능한 호일	미국 과학	2923-0110	플라스틱 도자기
아라실	엑셀 사이언티픽	나-100	플라스틱 도자기
2-메르캅토에탄올	피셔 사이언티픽	제034461-100	시험
온페이지	시그마-알드리치	73660	시험
나2CO3	시그마-알드리치	223484	시험
나2HPO4	시그마-알드리치	S3264 (영어	시험
나H2PO4	시그마-알드리치	S3139 (영어	시험
케이클	피셔 사이언티픽	BP366-500	시험
재질 보기 MgSO4	시그마-알드리치	83266	시험
염산(HCl)	피셔 사이언티픽	SA54-4	시험
드라이 배스	써모 피셔		장치
소용돌이	써모 피셔		장치
원심 분리기	에펜도르프	원심분리기 5810R	장치
플레이트 리더	분자 장치	SPECTRAMAX PLUS Microplate 분광 광도계	장치
부 화기	써모 피셔	모형: 5250-37 Degree, 6250-30 degrees	장치
셰이커 인큐베이터	뉴 브런즈윅		장치
수조	써모 피셔	아이소온도 205	장치
트리스 베이스	피셔 사이언티픽	BP152-1	시험

년 년 호 년 ) ) (영문)