Biotin-labeled RNA duplexes를 사용한 표적 단백질의 Helicase Activity 측정

초록

출처: Yu, L. et al., 단백질-핵산 상호 작용을 연구하기 위해 비오틴 라벨을 사용한 체외 생화학 분석. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오에서는 비오틴 표지된 dsRNA 기질을 풀기 위해 표적 단백질의 헬리카제 활성을 결정하는 절차를 보여줍니다. 효소의 활성은 전기영동 이동성 이동을 분석한 후 화학발광 효소 접합 스트렙타비딘을 사용하여 화학발광 분석을 통해 확인되었습니다.

프로토콜

1. 단백질 준비

1. MOV10 표현식 구문
   1. 마우스 MOV10을 인코딩하는 cDNA 발현 구조를 생성합니다.
      1. 각 단편에 대한 중합효소연쇄반응(PCR) 반응을 설정합니다. 50 μL.
         의 최종 부피에서 1 μL의 마우스 cDNA를 혼합하고, dNTP를 1 μL, 10 μM 전방 프라이머 2 μL, 10 μM 리버스 프라이머 2 μL, DNA 중합효소 1 μL, 2x PCR 완충액 25 μL, 이중 증류 H₂O(ddH₂O) 18 μL를 혼합합니다 메모: Mov10 유전자 단편의 증폭을 위한 프라이머는 표 1에 나열되어 있습니다.
      2. 다음 프로그램을 사용하여 PCR 반응을 수행합니다: 95°C에서 5분 동안 가열, 95°C에서 15초 동안 가열 35회, 64°C에서 15초 동안 어닐링, 72°C에서 20초 동안 연장(전체 길이 MOV10 확장의 경우 2분), 68°C에서 7분 동안 최종 연장.
   2. 겔 전기영동으로 증폭된 PCR DNA를 분석하고, UV 램프 아래에서 겔에서 필요한 크기의 밴드를 빠르게 잘라낸 다음 원심분리기 튜브에 넣습니다.
      메모: MOV10용 아가로스 겔에서 볼 수 있는 예상 제품 크기는 3015bp입니다.
   3. 제조업체의 프로토콜에 따라 겔 추출 키트로 PCR DNA를 정제합니다.
      1. 1.1.2단계에서 원심분리 튜브에 동일한 부피의 용해 완충액을 추가하고 겔 조각이 완전히 녹도록 50-55°C 수조에서 5-10분 동안 겔을 녹입니다. 튜브 벽에서 물방울을 모으기 위해 잠시 원심분리기를 사용합니다.
         메모: 겔과 용해 완충액의 질량/부피 농도는 1mg/μL입니다.
      2. 흡착 컬럼을 채취 튜브에 배치하고 용해된 겔 조각이 포함된 용액을 흡착 컬럼으로 옮긴 다음 12,000 x g에서 2분 동안 원심분리합니다.
      3. 수집 튜브 바닥에 있는 여과액을 폐기하십시오. 세척 완충액 600μL를 컬럼에 추가하고 12,000 x g에서 1분 동안 원심분리한 다음 여과액을 버립니다.
      4. 1.1.3.3단계를 한 번 반복합니다.
      5. 컬럼을 다시 수집 튜브에 넣고 12,000 x g에서 2분 동안 원심분리하여 남아 있는 모든 세척 버퍼를 제거합니다.
      6. 1.5mL 멸균 원심분리 튜브에 흡착 컬럼을 놓고 흡착 컬럼 중앙에 50μL의 ddH₂O를 첨가한 다음 1분 동안 12,000 x g에서 원심분리합니다. 분광 광도계를 사용하여 용리액의 DNA 농도를 측정합니다.
   4. 플라스미드의 제한 분해
      1. pRK5 벡터 4μg, 10x 분해 완충액 5μL, BamHI 1μL, XhoI 및 ddH_2O1μL를 최종 반응 부피 50μL로 혼합하여 pRK5 벡터를 BamHI 및 XhoI로 분해합니다. 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
   5. 겔 전기영동으로 벡터 DNA를 분석하고, UV 램프 아래의 메스로 겔에서 원하는 크기의 밴드를 빠르게 잘라 원심분리기 튜브에 넣습니다.
   6. 제조업체의 지침에 따라 1.1.3으로 겔 추출 키트로 벡터 DNA를 정제합니다.
   7. 10 μL.
      의 최종 반응 부피에서 0.03 pmol의 선형화된 벡터, 0.06 pmol의 cDNA 단편, 2 μL의 리가아제, 4 μL의 5x 리가제 완충액 및 ddH₂O를 결합하여 표준 재조합 결찰 반응을 설정합니다 메모: MOV10을 pRK5 벡터로 복제합니다.
   8. 혼합물을 37 ° C에서 30 분 동안 배양 한 다음 얼음에서 즉시 5 분 동안 반응을 냉각시킵니다. MOV10 재조합 플라스미드를 DH5α 박테리아로 변환합니다.
      메모: Sanger 염기서열분석(Sanger sequencing)을 통해 모든 재조합 구조를 검증합니다.
   9. 액체 배양액에 동일한 부피의 50% 글리세롤을 첨가하고 -80°C에서 보관하여 검증된 재조합 플라스미드를 포함하는 박테리아 배양의 글리세롤 스톡을 준비합니다.
      메모: 각 후속 실험에 대해 글리세롤 스톡의 박테리아를 새 한천 플레이트에 줄무늬를 만들고 1.2단계에서 설명한 대로 단일 콜로니를 사용하여 확장합니다.
2. MOV10 단백질은 HEK293T 세포에서 추출합니다.
   1. 배양된 HEK293T 세포에서 MOV10 단백질을 일시적으로 발현합니다.
      1. MOV10-pRK5 플라스미드를 >500ng/μL 농도로 준비합니다.
      2. 15cm 접시에 HEK293T 세포를 씨를 뿌립니다. 세포 밀도가 ~70%-90%에 도달하면 세포 배양 배지를 10%의 소 태아 혈청(FBS)과 1%의 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 신선한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)으로 교체합니다.
      3. 1회 transfection의 경우, 60μg의 MOV10-pRK5 플라스미드 DNA를 환원된 혈청 배지 3mL에 희석한 다음 120μL의 transfection enhancer 시약을 첨가하고 잘 혼합합니다.
      4. 별도의 튜브에서 90μL의 트랜스펙션 시약을 3mL의 환원된 혈청 배지(페니실린-스트렙토마이신 제외)로 희석하고 잘 혼합합니다.
      5. 희석된 DNA를 희석된 transfection 시약의 각 튜브에 추가합니다. 실온에서 15분 동안 배양합니다.
      6. transfection 혼합물을 세포 배양에 첨가하고 ~36-48시간 동안 세포를 배양합니다.
   2. 36-48시간 후 50mL 튜브의 각 플레이트에서 세포를 수집합니다. 500 x g에서 4°C에서 5분간 원심분리기. 각 펠릿을 10mL의 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하고 4°C에서 5분 동안 500 x g의 원심분리로 세포를 수집합니다.
   3. 완전한 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 없는 프로테아제 억제제 칵테일을 함유한 세포 용해 완충액 3mL에 펠릿을 재현탁합니다. 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 용해물을 20,000 x g 및 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다.
   4. 1.5mL 튜브에 세포 접시당 100μL의 anti-FLAG 마그네틱 비드를 추가합니다.
   5. K150 버퍼(pH 7.5에서 50mM HEPES, 150mM KoAc, 1mM DTT, 0.1% NP-40)로 마그네틱 비드를 2x 세척합니다.
      1. 마그네틱 비드를 1mL의 얼음처럼 차가운 K150 버퍼에 재현탁합니다.
      2. 4°C에서 2분 동안 부드럽게 회전하여 자성 비드를 배양하고 자석을 사용하여 자성 비드를 펠릿화합니다. 상층액을 제거하고 폐기합니다.
   6. 1.3.3 단계의 세포 용해물 상층액에 마그네틱 비드를 추가하고 4°C에서 2시간 동안 배양합니다.
   7. 단백질 결합 마그네틱 비드를 K150 버퍼로 3배 세척한 다음 250mM NaCl을 함유한 K150으로 2배, K150 버퍼로 3배를 1.3.5로 세척합니다.
   8. 300 μL의 FLAG 용출 완충액(pH 7.5, 5 mM MgCl₂, 10% 글리세롤에서 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl)에 비드를 재현탁시키고, FLAG 펩타이드를 0.5 μg/μL의 최종 농도로 첨가하고, 4 °C에서 1시간 동안 회전체에서 비드로 배양한 다음 자석을 사용하여 마그네틱 비드를 펠릿
   화합니다.
   9. 용출된 MOV10 단백질이 포함된 상등액을 수집하고, 농도를 측정하고, 향후 사용을 위해 -80°C에서 보관합니다.

2. 핵산 제제

1. 적절한 출처에서 비오틴 라벨이 있거나 없는 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드(올리고)를 구입하십시오. RNase-free ddH₂O에서 각 올리고를 20 μM로 희석하고 나중에 사용할 수 있도록 -80 °C로 유지합니다.
   메모: 본 연구에 사용된 DNA/RNA 기질의 올리고 서열은 표 2에 열거되어 있다.
2. MOV10 헬리카제 활성 분석을 위한 이중 가닥 RNA(dsRNA) 어닐링 반응을 위해 다음 혼합물을 준비합니다: pH 7.5, 6mM KCl, 0.2mM MgCl₂ 및 RNase-free ddH₂O에서 60mM N-2-하이드록시에틸피페라진-N-에탄-설폰산(HEPES)을 20μL의 최종 반응 부피에서 혼합합니다.
3. 어닐링 버퍼(단계 2.2)에서 비오틴 표지 상단 가닥(2μM, 최종 농도)과 표지되지 않은 상보적 하단 가닥의 1.5배의 혼합물을 95°C에서 5분 동안 가열하여 RNA 올리고를 어닐링한 다음 실온(RT)으로 천천히 냉각합니다.

3. 체외 생화학 분석

1. EMSA 및 효소 반응
   1. MOV10 헬리카제 활성 분석의 경우, pH 7.5에서 50mM Tris-HCl, 20mM KoAc, 2mM MgCl₂, 0.01% NP-40, 1mM DTT, 2U/μL RNase 억제제, 10nM 비오틴 표지 RNA 기질, 2mM 아데노신 삼인산(ATP), 100nM RNA 트랩, 20ng의 MOV10 단백질 및 ddH_2O를 20μL의 최종 반응 부피에서 혼합합니다. 반응 혼합물을 37°C에서 10분 동안 배양하고, 30분, 60분 5x 정지 버퍼를 추가하여 반응을 중지합니다.
      메모: RNA 트랩(RNA trap)은 표지된 올리고와 상보성(complementarity)을 가진 비오틴(biotin)이 표지되지 않은 올리고(oligo)에 대한 상보성을 가지고 있으며, 이는 unwound dsRNA가 다시 어닐링되는 것을 방지합니다.
2. 폴리아크릴아미드 겔
   1. 젤 플레이트(16cm x 16cm)와 1.5mm 빗을 세척합니다. 겔 전기영동 장치를 조립합니다.
   2. 10% 천연 폴리아크릴아미드 겔을 준비하려면 ddH₂O 14mL, 10x Tris-boric acid-EDTA(TBE) 1.25mL, 30% 아크릴아미드 8.3mL, 50% 글리세롤 1.25mL, 10% 갓 준비된 과황산암모늄(APS) 187.5μL 및 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 12.5μL를 혼합합니다.
   3. 20% 천연 폴리아크릴아미드 겔을 준비하려면 ddH₂O 5.5mL, 10x TBE 1.25mL, 50% 글리세롤 1.25mL, 30% 아크릴아미드 16.7mL, 10% APS 187.5μL 및 TEMED 12.5μL를 혼합합니다.
   4. 아크릴아미드 용액을 즉시 젤에 붓고 빗을 삽입합니다. 혼합물을 약 30분 동안 중합시킵니다.
3. 젤 러닝
   1. 빗을 제거하고 탱크에 전기영동 러닝 버퍼(0.5x TBE)를 채웁니다.
   2. 샘플 웰을 0.5x TBE 버퍼로 헹군 다음 얼음에서 100V로 30분 동안 겔을 사전 실행합니다. 실행 버퍼를 새 0.5x TBE로 교체합니다.
   3. 각 웰에 20-25 μL 샘플을 로드합니다.
   4. EMSA 분석에는 10% 천연 아크릴아미드 겔을 사용하고 효소 분석에는 20% 천연 아크릴아미드 겔을 사용합니다. 브로모페놀 블루 마커가 겔의 하단 분기로 이동할 때까지 얼음 수조에서 100V로 전기영동을 실행합니다.
4. 겔 플레이트를 분해하고 로딩 웰과 사용하지 않는 레인을 제거하여 겔을 다듬습니다. 겔을 0.5x TBE 버퍼에 넣습니다.
5. 여과지와 나일론 멤브레인을 젤 크기로 자릅니다. 깨끗한 여과지와 나일론 멤브레인을 미리 적십니다.
6. 전송할 스택을 조립합니다.
   1. 사전 습윤 멤브레인을 사전 습식 여과지 위에 놓습니다.
   2. 멤브레인에 젤을 놓습니다.
   3. 미리 젖은 여과지로 젤을 다른 층으로 덮습니다.
   4. 깨끗한 피펫을 중앙에서 가장자리로 굴려 모든 기포를 제거합니다.
7. 샘플을 겔의 샘플을 90mA에서 20분 동안 반건조 전기영동 장치에서 멤브레인으로 옮깁니다.
8. 전송을 중지 한 다음 새 여과지에서 멤브레인을 1 분 동안 건조시킵니다.
9. 254nm 전구가 장착된 자외선 가교제에서 45-60초 동안 120mJ/^cm2로 멤브레인을 조사하여 샘플을 가교합니다(자동 가교 기능). RT에서 멤브레인을 30분 동안 자연 건조합니다.
10. 화학발광 검출
    1. 프로토콜 1: 표준 부피의 상용 화학발광 핵산 검출 키트를 사용합니다.
       1. 멤브레인에 20mL의 블로킹 버퍼를 추가하고 20-25rpm의 회전체를 부드럽게 흔들면서 15-30분 동안 배양합니다.
       2. 20mL의 차단 완충액에 66.7μL 안정화된 streptavidin-horseradish peroxidase conjugate를 추가하여 conjugate/blocking buffer solution을 준비합니다.
       3. 블로킹 버퍼를 부드럽게 제거하고 conjugate/blocking 버퍼로 교체합니다. 20-25 rpm의 회전체에서 15분 동안 배양합니다.
       4. 멤브레인을 40-45rpm으로 각각 5분 동안 흔들면서 4번 세척합니다.
       5. 멤브레인에 30mL의 기질 평형 완충액을 추가합니다. 20-25rpm으로 흔들면서 5분 동안 멤브레인을 배양합니다.
       6. 6mL의 안정적인 과산화물 용액에 6mL의 루미놀/인핸서 용액을 첨가하여 기질 작업 용액을 준비합니다. 빛을 피하십시오.
       7. 멤브레인의 전체 표면을 기질 작업 용액으로 덮고 5 분 동안 배양합니다.
       8. 화학발광 이미징 시스템에서 멤브레인을 1-3초 동안 스캔합니다.

표 1: PCR이 Meiob 및 Mov10의 유전자 단편을 증폭하는 데 사용되는 프라이머.정방향 및 역방향 프라이머의 굵은 글씨체는 BamHI 및 NotI 절단 사이트입니다. 역 프라이머의 이탤릭체 굵은 글씨체는 XhoI 절단 사이트입니다. 상자 안의 굵은 글씨체는 점 돌연변이 R235A에 해당하는 뉴클레오티드를 나타냅니다.

조각	뇌관	시퀀스 (5'에서 3'까지)
MEIOB-A	전달	CGGGATCCATGTTACTTTCTTTGATACACTTGCC
	후진	ATGCGGCCGC전술타그트크트GTTCCACTG
MEIOB-C	전달	CCGCGTGGATCCATGGAACCAAAATACTTTACAACTTCA
후진	CGATGCGGCCGCCTCTTTTTTTCTCTTATATAATTCAGTAG
MEIOB-E	전달	CCGCGTGGATCCATGTTACTTTCTTTGATACACTTGCC
후진	CGATGCGGCCGC전술TAGCTGTTCCACTG
MEIOB-E-mut	전달	CTCTGATGTGGCA아타아아텟타액
후진	GTTAAAATTTATTGCCACATCAGAG
MOV10	전달	GACGACGATGACAAGGAGATCCATGCC태그카AGTCAGCTGCC
후진	GCTTACTCAGCTAAGCTCGAGTCAGAGCTCATTTCTCCACTCTG

표 2: 이 작업에 사용된 DNA/RNA 기질의 서열.

그림의 경우	이름	시퀀스 (5'에서 3'까지)
그림 2, 5	36 nt ssDNA	5'-비오틴-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-3'(DNA)
그림 3	36 nt ssRNA	5'-비오틴-GUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGU-3' (RNA)
그림 4	54 nt 5' 꼬리 dsRNA	5'-비오틴-ACCGCUGCCGUCGCUCCG-3'(RNA) 5'-ACGAGGGAGACGAGGAGACGGAGCGACGGCAGCGGU-3'(RNA)

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
설비
원심 분리기	Eppendorf, 독일	5242R
화학발광 이미징 시스템	Tanon, 중국	5200
디지털 소니퍼	Branson, 미국	BBV12081048A	450와트, 50/60HZ
반건조 전기영동 블로터	Hoefer, 미국	TE77XP
튜브 리볼버	Crystal, 미국	3406051
자외선 가교제	UVP, 미국	CL-1000
자료
나일론 멤브레인	Thermo Scientific, 미국	TG263940A
TC 처리 된 배양 접시	코닝, 미국	430167	100의 mm
TC 처리 된 배양 접시	코닝, 미국	430597	150의 mm
마이크로튜브 튜브	AXYGEN, 미국	MCT-150-C	1.5 밀리리터
튜브	코닝, 미국	430791	15 밀리리터
시약
Anti-FLAG M2 마그네틱 비드	Sigma, 미국	M8823
ATP	Thermo Scientific, 미국	591136
BCIP/NBT 알칼리성 인산가수분해효소 색상 개발 키트	Beyotime, 중국	C3206 (영문
CelLyticTM M 세포 용해 시약	Sigma, 미국	107M4071V의
ClonExpress II 1단계 클로닝 키트	Vazyme, 중국	C112 (영문
화학발광 핵산 검출 키트	Thermo Scientific, 미국	T1269950
디엔피	Sigma-Aldrich, 미국	DNTP100-1KT
DMEM을 참조하십시오.	Gibco, 미국	10569044
에디타	Invitrogen, 미국	AM9260G	0.5 미터
EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일	Roche, 미국	4693132001
EndoFree 맥시 플라스미드 키트	Vazyme, 중국	DC202
FastPure 젤 DNA 추출 미니 키트	Vazyme, 중국	재질 보기 DC301-01
FBS(증권 시세	Gibco, 미국	10437028
FLAG 펩타이드	Sigma, 미국	F4799
글리세롤	Sigma, 미국	SHBK3676
HEPES 버퍼	Sigma, 미국	SLBZ2837	1 미터
KOAc	Sangon Biotech, 중국	127-08-02
마그네슘Cl2	Invitrogen, 미국	AM9530G	1 미터
염화나트륨	Invitrogen, 미국	AM9759	5분
NP-40	Amresco, 미국	M158-500ML
Opti-MEM 배지	Gibco, 미국	31985062
PBS (PBS)	Gibco, 미국	10010023	산도 7.4
RNase 억제제	Promega, 미국	N251B
스트렙타비딘 알칼리성 인산가수분해효소	Promega, 미국	V5591
증권 시세	Invitrogen, 미국	15581044
트리스-HCI 버퍼	Invitrogen, 미국	15567027	1M, pH 7.4
트리스-HCI 버퍼	Invitrogen, 미국	15568025	1m, pH 8.0
트윈-20	Sangon Biotech, 중국	A600560

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