DNA 복구 단백질 상호 작용의 면역형광 기반 시각화

초록

출처: de la Peña Avalos, B., et al., 면역형광에 의한 DNA 복구 단백질 상호 작용의 시각화. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오에서는 방사선 조사된 세포핵의 이중 가닥 DNA 절단 부위에서 DNA 복구 단백질 γH2AX 및 53BP1의 국소화를 시각화하기 위한 면역형광 방법에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. 핵 추출 및 세포 고정

1. 원액 준비: 0.2 M PIPES(pH 6.8), 5 M NaCl, 2 M 자당, 1 M MgCl₂, 0.1 M EGTA(pH 8.0).
2. 핵 추출 완충액(NEB) 제조: 10mM PIPES(pH 6.8), 100mM NaCl, 300mM 수크로스, 3mM MgCl₂, 1mM EGTA(pH 8.0) 및 0.5%(v/v) Triton X-100을 ddH₂O에 용해합니다. 완전히 용해될 때까지 혼합합니다.
3. 4%(v/v) 파라포름알데히드(PFA) 준비: 16% PFA 수용액 10mL를 30mL PBS에 용해시킵니다. 완전히 녹을 때까지 섞습니다.
4. 적절한 시점(t=0, 1, 2, 4, 16시간)에서 1mL의 PBS로 셀을 두 번 세척합니다. PBS를 완전히 제거합니다.
5. 세포핵 추출을 위해 각 웰에 200μL의 NEB를 추가합니다(세포질은 분해되고 핵만 남음)(그림 1).실온에서 2분 동안 배양하고 완전히 제거합니다.
   메모: 2분을 초과하지 마십시오.
6. PBS 1mL로 세포를 세척합니다. PBS를 완전히 제거합니다. PBS를 조심스럽게 추가하면 이 단계에서 세포가 매우 취약합니다.
7. 세포 고정을 위해 각 웰에 200μL의 4%(v/v) PFA를 추가합니다. 4 °C에서 10분 동안 배양합니다. PFA를 완전히 제거합니다.
8. PBS.
   1mL 추가 메모: 세포는 4°C의 PBS에 보관할 수 있습니다.

2. 면역형광 염색

1. 차단 용액 준비: PBS에 5% BSA(w/v)를 용해하고 0.3%(v/v) Triton X-100을 첨가합니다. 완전히 녹을 때까지 섞습니다.
2. 희석 완충액 준비: PBS에 1% BSA(w/v)를 용해하고 0.3%(v/v) Triton X-100을 첨가합니다. 완전히 녹을 때까지 섞습니다.
3. 차단을 위해 각 웰에 200μL의 차단 용액을 추가합니다. 실온에서 2 시간 또는 4 °C에서 16-18 시간 동안 배양하십시오 .
   메모: 염소 항체를 사용할 경우 차단 용액에 염소 혈청 5%를 첨가하십시오.
4. 1차 항체를 희석 완충액(1:500, 항체 목록은 표 1 참조)에 희석하고 잘 혼합될 때까지 와류를 일으킵니다.
   메모: 염소 항체를 사용하는 경우 희석 완충액에 염소 혈청 1%를 첨가합니다.
5. 습도/배양 상자에 파라필름 조각을 부착합니다. 10μL의 1차 항체를 추가합니다(1방울). 커버슬립의 한쪽 가장자리를 드롭에 맞추고 액체가 전체에 퍼지도록 파라필름 위로 천천히 내립니다(가능하면 거품을 피하십시오). 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
6. PBS에서 1분 동안 커버슬립을 세 번 세척합니다.
7. 2차 항체를 희석 완충액(최종 농도: 2μg/mL)에 희석하고 잘 혼합될 때까지 와류를 일으킵니다.
8. 1차 항체에 대해 설명된 대로 10μL의 2차 항체를 적용합니다. 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
   메모: 빛으로부터 보호하십시오.

표 1: 사용된 항체. 이 연구에 사용된 항체 목록.

년 호

항체	회사	참조	근원
53BP1	세포 신호 전달	4937	토끼
안티 마우스 IgG H&L (Alexa Fluor 647)	아브캠	AB150103	당나귀
안티 포스포 히스톤 H2A. X(Ser139), 클론 JBW301	밀리포어	제05-636	마우스
안티-래빗 IgG H&L (Alexa Fluor 488)	아브캠	AB150081	염소

1. PBS에서 1분 동안 커버슬립을 세 번 세척합니다.
2. 커버 슬립을 H₂O로 1 분 동안 세척하십시오.
3. DAPI를 사용한 DNA 대조염색: 10μL의 300nM DAPI(항체에 대해 설명된 대로)를 적용하고 실온에서 30분 동안 배양한 다음 글리세롤 기반 장착 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 장착합니다. 또는 DAPI가 포함된 상업용 페이드 방지 장착 매체 한 방울(10μL)을 슬라이드에 추가하고 커버슬립을 적용합니다. 커버슬립을 부드럽게 누르고 종이 타월로 주변의 과도한 액체를 제거합니다.
4. 투명 매니큐어로 커버슬립을 밀봉하고 20분 동안 말리십시오.
5. 슬라이드는 4°C에서 보관하십시오.

3. 이미지 획득

1. 60x 대물 렌즈에 이멀젼 오일 한 방울을 떨어뜨립니다. DAPI를 사용하여 접안렌즈를 통해 핵을 찾습니다.
   1. XYZ 이미지 획득의 경우 획득 소프트웨어를 열고 매개변수를 선택합니다. 스캐너 유형: Galvano; 스캐너 모드: 왕복; 이미지 크기: 512×512; PMT 모드: VBF; PMT 평균: 프레임(4회); PMT 순차 스캔: 라인.
   2. 염료와 검출기를 선택합니다.
      채널(CH1), 염료(DAPI), 검출기(SD1)
      채널(CH2), 염료(Alexa Fluor 488), 검출기(HSD3)
      채널(CH3), 염료(Alexa Fluor 647), 검출기(HSD4)
   3. "Z"에서 ON을 선택합니다.
2. 라이브 이미지를 조정합니다. 라이브 창에서 라이브 버튼을 누릅니다.
   1. 초점을 조정하고 "PMT" 도구 창에서 레이저 강도(%), 감도(HV), 게인 및 오프셋을 설정합니다.
      1. 레이저 강도 (%) 조정 : 밝기 및 표백을 위해. 레이저 강도가 높을수록 신호가 강해지지만 표본은 광표백됩니다.
      2. 감도(HV) 조정: 소음 수준. HV가 높을수록 신호가 강해지지만 너무 높으면 이미지에 노이즈가 발생합니다.
         알림: 항상 볼륨을 유지tage 일정한.
      3. 오프셋: 배경 수준을 조정합니다.
   2. Z 스택에 대해 시작/끝(15개 조각)을 선택합니다.
3. 인수를 시작합니다.
   1. 이미지를 저장할 폴더를 선택합니다. LSM Start 버튼을 눌러 이미지 획득을 시작합니다. Series Done 버튼을 눌러 이미지 획득을 완료합니다.

결과

그림 1. 핵 추출.

핵 추출 전(왼쪽)과 핵 추출 후(오른쪽)의 세포를 대표하는 이미지. 세포질은 소화되어야 하지만 핵 구조는 추출 후 그대로 유지되어야 합니다(오른쪽). (A) 20배 확대; 눈금 막대 = 20 μm 및 (B) 40 배 배율; 스케일 바 = 10μm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
커버 글라스 # 1, 18mm 원형 (커버 슬립)	호중시험관	NC0308920	커버슬립은 HCl 또는 에탄올과 함께 사용하기 전에 세척하고 멸균해야 합니다.
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음	지브코	14190144	조직 배양을 위한 PBS
DBI가 있는 SlowFade Diamond Antifade Mountant	인비트로젠	S36973	VECTASHIELD 안티페이드 마운팅 미디어가 있는 300nM DAPI를 대신 사용할 수 있습니다.
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치	A3059	강수/배경을 피하기 위해 열 충격 분율이 권장됩니다.
트리톤 X-100	아메리칸바이오	AB02025	핵 추출 버퍼.
Superfrost Plus 현미경 슬라이드	피셔브랜드	1255015	대신 폴리사인 슬라이드를 사용할 수 있습니다.