DNA 복구 단백질 상호 작용의 면역형광 기반 시각화

방법 논문

2025년 7월 8일

이 논문에서

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이 비디오에서는 방사선 조사된 세포핵의 이중 가닥 DNA 절단 부위에서 DNA 복구 단백질 γH2AX 및 53BP1의 국소화를 시각화하기 위한 면역형광 방법에 대해 설명합니다.

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1. 핵 추출 및 세포 고정

원액 준비: 0.2 M PIPES(pH 6.8), 5 M NaCl, 2 M 자당, 1 M MgCl₂, 0.1 M EGTA(pH 8.0).
핵 추출 완충액(NEB) 제조: 10mM PIPES(pH 6.8), 100mM NaCl, 300mM 수크로스, 3mM MgCl₂, 1mM EGTA(pH 8.0) 및 0.5%(v/v) Triton X-100을 ddH₂O에 용해합니다. 완전히 용해될 때까지 혼합합니다.
4%(v/v) 파라포름알데히드(PFA) 준비: 16% PFA 수용액 10mL를 30mL PBS에 용해시킵니다. 완전히 녹을 때까지 섞습니다.
적절한 시점(t=0, 1, 2, 4, 16시간)에서 1mL의 PBS로 셀을 두 번 세척합니다. PBS를 완전히 제거합니다.
세포핵 추출을 위해 각 웰에 200μL의 NEB를 추가합니다(세포질은 분해되고 핵만 남음)(그림 1).실온에서 2분 동안 배양하고 완전히 제거합니다.
메모: 2분을 초과하지 마십시오.
PBS 1mL로 세포를 세척합니다. PBS를 완전히 제....

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그림 1. 핵 추출.

핵 추출 전(왼쪽)과 핵 추출 후(오른쪽)의 세포를 대표하는 이미지. 세포질은 소화되어야 하지만 핵 구조는 추출 후 그대로 유지되어야 합니다(오른쪽). (A) 20배 확대; 눈금 막대 = 20 μm 및 (B) 40 배 배율; 스케일 바 = 10μm.

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선언된 이해 상충이 없습니다.

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호	댓글
커버 글라스 # 1, 18mm 원형 (커버 슬립)	호중시험관	NC0308920	커버슬립은 HCl 또는 에탄올과 함께 사용하기 전에 세척하고 멸균해야 합니다.
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음	지브코	14190144	조직 배양을 위한 PBS
DBI가 있는 SlowFade Diamond Antifade Mountant	인비트로젠	S36973	VECTASHIELD 안티페이드 마운팅 미디어가 있는 300nM DAPI를 대신 사용할 수 있습니다.
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치	A3059	강수/배경을 피하기 위해 열 충격 분율이 권장됩니다.
트리톤 X-100	아메리칸바이오	AB02025	핵 추출 버퍼.
Superfrost Plus 현미경 슬라이드	피셔브랜드	1255015	대신 폴리사인 슬라이드를 사용할 수 있습니다.

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