방법 논문

친화성 추출을 통해 RNA 결합 단백질을 분리하기 위한 RNA-단백질 풀다운 분석

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Kresoja-Rakic, J., et al. Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity는 중피종 세포에서 RNA 상호 작용 단백질의 정제를 매개했습니다. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오는 mRNA에서 아데닐레이트-우리딜레이트-풍부 요소(ARE) 염기서열과 상호 작용하는 RNA 결합 단백질(RBP)을 식별하기 위한 체외 RNA 풀다운 분석을 보여줍니다. 세포 용해물의 표적 RBP는 RNA 프로브와 혼합되어 RNA 단백질 복합체를 형성합니다. 이 복합체는 RNA 프로브의 desthiobiotin 라벨과 streptavidin-labeled magnetic bead의 친화성을 활용하여 친화성 정제를 통해 분리됩니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 세포질 및 핵 단백질 분획의 준비

  1. 10% FBS, 1x 페니실린/스트렙토마이신(100x) 및 2mM L-글루타민(200mM)이 보충된 RPMI - 1640 배지에서 성장한 T150 세포 배양 플라스크의 플레이트 4 x 106 ACC-MESO-4 세포. 세포가 80-90%(~5-5.5 x 106 세포)의 합류점에 도달하면 핵 및 세포질 분획의 단백질 추출을 진행합니다.
    메모: ACC-MESO-4 세포주는 RIKEN BioResource Centre에서 획득했습니다.
  2. 배지를 흡인하고, 1x PBS 15mL를 추가하여 세포를 세척하고, 플레이트를 약간 부드럽게 기울이고, 1x PBS를 흡인합니다. 0.25% 트립신-EDTA 3mL를 첨가하고 배양 플라스크를 37°C에서 3분 동안 배양합니다.
    메모: 분리를 위해 현미경으로 세포를 살펴보십시오. 그래도 부착되어 있으면 플라스크를 손바닥에 대고 3번 두드립니다.
  3. 10% FBS, 페니실린/스트렙토마이신 1개(100x) 및 2mM L-글루타민(200mM)이 보충된 RPMI-1640 배지 7mL를 추가하고 15mL 튜브에 세포를 모은 다음 200 x g에서 5분 동안 스핀다운합니다.
  4. 배지를 흡인하고 1.5mL의 1x PBS로 세포 펠렛을 재현탁한 다음 세포를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 500 x g 및 4°C에서 5분 동안 스핀 다운합니다. 상층액을 버립니다.
    메모: 이 단계부터 4°C에서 모든 원심분리 단계를 수행하고 모든 시약을 얼음 위에 보관합니다.
  5. 얼음처럼 차가운 1.5mL의 1x PBS로 세포 펠릿을 재현탁하고 500 x g 및 4°C에서 3분 동안 세포를 스핀다운합니다. 상등액을 폐기합니다.
    메모: CER I, CER II 및 NER 시약의 필요한 양은 각각 추정 세포 펠릿 포장 부피의 10, 0.55 및 5 부피입니다. 다음 프로토콜은 20μL의 부피를 가정합니다. 필요한 양의 시약 CER I만 준비하는 것이 좋습니다.
  6. 2μL의 1x 단백질분해효소 억제제가 보충된 200μL의 얼음처럼 차가운 세포질 추출 시약(CER I)을 추가합니다(예: 500μL의 물에 1정제의 프로테아제 억제제(EDTA-free)를 희석하여 100x 스톡을 얻습니다. 이 양의 시약 CER I은 20μL의 세포 펠릿으로 채워진 부피를 용해하기에 충분합니다.
    1. 세포 펠릿이 충전된 부피를 추정하려면 세포 펠릿이 들어 있는 튜브를 10, 20, 50 또는 100μL의 1x PBS로 채워진 1.5mL 튜브와 비교합니다.
  7. 15초 동안 튜브를 격렬하게 와류로 가열하여 세포 펠릿을 재현탁하고 10분 동안 얼음 위에서 튜브를 배양합니다. 11μL의 얼음처럼 차가운 세포질 추출 시약 II(CER II)를 튜브에 추가하고 5초 동안 격렬하게 와류를 일으킨 다음 얼음 위에서 1분 동안 배양합니다.
  8. 5초 동안 격렬하게 소용돌이치고 16,000 x g 및 4°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리한 다음 상층액을 얼음 위의 깨끗하고 미리 냉각된 튜브로 옮깁니다. 상등액은 RNA-pulldown 실험에 추가로 사용되는 세포질 분획입니다.
  9. 1μL의 단백질 분해 효소 억제제(100x)가 보충된 100μL의 얼음처럼 차가운 핵 추출 시약(NER)에 나머지 펠릿을 재현탁하고 15초 동안 격렬하게 와류를 일으킵니다. 프로테아제 억제제가 보충된 필요한 양의 NER 시약만 준비하는 것이 좋습니다.
  10. 얼음 위에서 40분 동안 샘플을 배양하고 가끔 15초(10분마다) 소용돌이치게 합니다.
  11. 16,000 x g에서 10분 동안 튜브를 원심분리하고 상층액(핵 단백질 분획)을 깨끗하고 미리 냉각된 튜브로 옮깁니다.
  12. 즉시 bicinchoninic (BCA) 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정하여 진행하십시오 (재료 표 참조). 각 분획의 단백질 순도를 제어하기 위해 α-tubulin(세포질 분획에서만 양성 검출) 및 Poly ADP-ribose 중합효소 - PARP(핵 분획에서만 양성 검출)에 대한 면역 블로팅(그림 1)을 수행합니다.
  13. 단백질 활성과 기본 상태를 유지하려면 25μL의 세포질 및 핵 추출물 부분 표본을 준비합니다. 이러한 부분 표본을 액체 질소에 5초 동안 넣어 급속 동결하고 -80 °C에서 직접 보관합니다.

2. Desthiobiotin을 사용한 RNA 라벨링

  1. RNA 프로브를 상업적으로 합성하고 HPLC를 정제합니다. 10 μM.
    에서 뉴클레아제가 없는 물로 재현탁합니다. 메모: 프로브 시퀀스는 표 1에 나열되어 있습니다.
  2. RNA-풀다운 반응당 50 pmol의 RNA를 사용합니다. RNA 올리고의 3' 말단을 라벨링하는 데 사용되는 PEG 30%를 제외한 모든 시약을 얼음 위에서 해동하고 보관합니다.
  3. CALB2 3' UTR (ARE), CALB2 3' UTR (mtARE) 및 Unrelated-RNA (IRE)로 표시된 5 μL의 10 μM RNA 프로브를 0.5 mL 박막 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 85 °C의 PCR 기계에서 5분 동안 배양합니다.튜브를 즉시 얼음 위에 놓습니다.
    메모: 이 단계는 라벨링을 위한 RNA 프로브의 이완 및 접근성을 촉진하기 때문에 중요합니다.
  4. 단일 30 μL 반응의 경우, RNA 함유 튜브에 다음 10 μL 혼합물을 추가합니다: 뉴클레아제가 없는 물 3 μL, 10x RNA 리가제 반응 완충액 3 μL, RNase 억제제 1 μL(40 U/μL), 데스티오비오틴화 시티딘 비스포스페이트 1 μL (1 mM) 및 T4 RNA 리가제 2 μL (20 U/μL).
    메모: 3개 이상의 샘플(3.2)에 대해 마스터 믹스 A를 준비하려면 9.6μL의 뉴클레아제가 없는 물, 9.6μL의 10x RNA 리가아제 반응 완충액, 3.2μL의 RNase 억제제(40 U/μL), 3.2μL의 Desthiobiotinylated 시티딘 비스포스페이트(1mM) 및 6.4μL의 T4 RNA 리가제(20 U/μL)를 혼합합니다.
  5. 15μL의 PEG 30%를 반응에 조심스럽게 첨가합니다. 다른 팁을 사용하여 반응을 혼합하십시오. 16 °C에서 밤새 반응을 배양합니다.
  6. 다음날, 5M NaCl(신선/뉴클레아제 없음), 클로로포름: 24:1 비율의 이소아밀 알코올(예: 반응당 - 96μL 클로로포름 및 4μL의 이소아밀 알코올), 얼음처럼 차가운 100% 에탄올 및 얼음처럼 차가운 70% 에탄올을 준비합니다.
  7. 70μL의 뉴클레아제가 없는 물을 RNA 라벨링 반응 튜브에 추가합니다. 클로로포름 100μL를 추가합니다: 이소아밀 알코올과 와류를 짧게 추가합니다. 13,000 x g에서 3분 동안 스핀다운. 상상부(upper phase)만 조심스럽게 제거하고 뉴클레아제가 없는 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 하단 단계를 만지지 마십시오.
  8. 5M NaCl 10μL, 글리코겐 1μL, 얼음처럼 차가운 100% 에탄올 300μL를 추가합니다. 튜브를 -20°C에서 2시간 동안
    놓습니다. 메모: 이 단계에서는 다음 날에도 실험을 계속할 수 있습니다.
  9. 13,000 x g 및 4°C에서 15분 동안 원심분리기. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 폐기합니다. 얼음처럼 차가운 70% 에탄올 300μL를 첨가하고 13,000 x g 및 4°C에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.
  10. 상등액을 완전히 버리고 펠릿을 자연 건조시킵니다(15분). 펠릿을 뉴클레아제가 없는 물 20μL에 재현탁합니다.
    메모: 당일 RNA 풀다운을 진행합니다.
  11. RNA를 90°C에서 2분 동안 배양하고 얼음 위에 놓습니다. 스트렙타비딘 마그네틱 비드를 사전 세척하는 다음 단계에서 라벨링된 RNA를 얼음 위에 놓습니다.
    메모: 배양 시간이 길면 RNA 프로브가 손상될 수 있습니다.

3. RNA-단백질 풀다운

  1. streptavidin-magnetic beads를 사전 세척하고 desthiobiotin-RNA를 사용한 배양
    1. 50 pmol RNA당 50 μL의 streptavidin 마그네틱 비드를 사용합니다. 그러나 이는 실험에 따라 최적화되어야 합니다.
    2. 스트렙타비딘 마그네틱 비드로 튜브를 15초 동안 볼텍스하고 절단 피펫 팁을 사용하여 깨끗한 1.5mL 안전 잠금 튜브에 200μL(마스터 믹스, 3+1 반응에 충분)를 빠르게 제거합니다. 비드가 튜브 측면에 모이도록 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 1분 동안 기다립니다. 재현탁액을 제거합니다.
    3. 비드를 세척하려면 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 400μL의 0.1M NaOH와 0.05M NaCl 용액을 첨가한 다음 여러 번 위아래로 부드럽게 피펫을 펌핑합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 다시 놓습니다. 1분 정도 기다렸다가 상층액을 수집합니다. 이 단계를 다시 반복합니다.
    4. 200μL의 100mM NaCl로 비드를 세척합니다. 상층액을 제거합니다.
    5. 200μL의 20mM Tris(pH 7.5)를 추가하고, 피펫팅으로 비드를 재현탁하고, 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 1분 동안 기다린 다음 상등액을 제거합니다. 단계를 반복합니다.
    6. 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고, 200μL의 1x RNA Capture 버퍼를 추가하고, 잠시 볼텍싱(vortexing)을 통해 스트렙타비딘 마그네틱 비드를 재현탁합니다. 50 μL의 스트렙타비딘 마그네틱 비드를 제거하고 절단된 피펫 팁을 사용하여 라벨링된 각 RNA 튜브에 추가합니다. 롤러에서 실온에서 30분 동안 튜브를 배양합니다.
  2. 단백질과 RNA의 결합
    1. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 1분 정도 기다린 후 상등액을 제거합니다.
    2. 비드에 50μL의 20mM Tris(pH 7.5)를 추가하고 피펫팅으로 재현탁합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 1분 정도 기다린 후 상등액을 제거합니다. 이 단계를 반복합니다.
    3. 비드에 100 μL의 1x Protein-RNA 결합 완충액을 추가하고 피펫팅으로 재현탁합니다.
    4. 그 동안 10 μL의 10x 단백질-RNA 결합 완충액, 30 μL의 50% 글리세롤, 50 μg의 세포질 단백질, 최대 100 μL.
      의 뉴클레아제가 없는 물을 준비합니다. 메모: 33 μL의 10x 단백질-RNA 결합 완충액, 99 μL의 50% 글리세롤, 165 μg의 세포질 단백질 및 최대 330 μL의 뉴클레아제가 없는 물 3개 샘플에 대해 마스터 믹스 B를 준비합니다.
    5. 튜브를 마그네틱 스탠드에 넣고 1분 정도 기다린 후 상층액을 수집합니다. 100 μL의 마스터 믹스 B를 추가하고, 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 다시 부유시키며, 기포가 생성되지 않도록 합니다. 롤러에서 4°C에서 60분 동안 반응 튜브를 배양합니다.
  3. 세척 및 용출
    1. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 상층액(흐름을 통한 - FT)을 모으고 새 튜브로 옮깁니다.
      메모: 나중에 분석할 수 있도록 이 FT를 얼음 위에 보관하십시오.
    2. 피펫 100μL의 1x 비드에 버퍼를 세척하고, 부드럽게 재현탁한 다음 마그네틱 스탠드에 다시 넣고 1분 동안 기다렸다가 상등액을 버립니다. 이 단계를 2회 반복합니다.
    3. 마그네틱 비드에 40 μL의 용리 버퍼를 추가하고, 위아래로 피펫팅하여 혼합한 후 튜브 셰이커(950 rpm)에서 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.
    4. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 1분 정도 기다린 후 용리된 샘플(용리액 - E)을 수집합니다. 얼음 위에 놓고 다운스트림 분석에 사용합니다.
      메모: 이 단계에서 테스트된 각 RNA 프로브는 관류(FT) 및 용리액(E) 샘플로 구성됩니다.

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결과

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그림 1: 5μg의 세포질 및 핵 단백질 분획에 대한 웨스턴 블롯 분석. PARP 단백질은 핵 분획(N)에 존재하지만 세포질(C) 분획에는 없습니다. α-튜불린은 세포질 분획(C)에 존재하지만 핵 분획(N)에는 없습니다.

표 1: RNA 프로브의 염기서열

RNA 프로브순서농도
CALB2 3' U...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
NE-PER 핵 및 세포질 추출 키트써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific78833
Pierce 프로테아제 억제제 정제, EDTA 무함유써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher ScientificA32965
Pierce BCA 단백질 분석 키트써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific23225
Pierce 마그네틱 RNA-단백질 풀다운 키트써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific20164마그네틱 비드가 포함되어 있으므로 키트를 4°C에서 보관해야 합니다.
Pierce RNA 3' 말단 Desthiobiotinylation Kit써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific20163이 키트는 "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit"의 일부이며 풀다운 키트(4°C)와 달리 -20°C에서 보관해야 합니다.
DynaMag-2, 마그네틱 스탠드써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific12321디
RPMI - 1640 매체시그마-알드리치R8758
FBS - 여과 소 세럼(주)팬바이오텍P40-37500
페니실린 - 스트렙토마이신(100개)시그마-알드리치P4333
L-글루타민 용액(200mM)시그마-알드리치G7513
0.25% 트립신-EDTA (1x)Life technologies의 Gibco제25200-056
RNaseZap RNase 오염 제거 솔루션써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher ScientificAM9780
RNA 올리고 합성Mycrosynth AG, 스위스-합성 스케일 - 0.04 μmol - HPLC 정제
소 혈청 알부민시그마-알드리치A7030
염산(HCl) 6mPanReac AppliChem제182883.1211
울트라 퓨어 1M 트리스, pH 7.5써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific15567027
글리세롤써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific1790450% 멸균 분취액은 -20°C에서 보관
Pierce Streptavidin 마그네틱 비드써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific88817이 마그네틱 비드의 평균 직경은 1 μm (0.5 - 1.5 μm 범위)입니다. 또한, 2.8 μm 크기의 균질성 비드인 Dynabeads-M280 Streptavidin도 RNA-pulldown에 사용되지만, 이는 정제 과정에 영향을 미칠 수 있습니다.
알루미늄 황산염 - (14-18) - 수화물시그마-알드리치368458
오르토 인산애플리켐A0637
) ) ) 년 ) 년 ) 년 ) 호 ) 호 ) ) 년 )

재인쇄 및 허가

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RNARNARNA

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