RNA-단백질 상호작용을 식별하기 위한 SELEX 기반 체외 결합 분석

1. 단백질 결합 반응 및 결합 RNA 분리

1. 이 최종 농도에 다음 성분을 첨가하여 100 μL의 부피에서 10 mM Tris-HCl, pH 7.5에서 단백질과 RNA의 결합을 수행하십시오 : 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.09 μg / μL 소 혈청 알부민, 0.5 단위 / μL RNasin, 0.15 μg / μL tRNA, 1 mM EDTA, 및 30μL의 적절한 재조합 단백질(PTB) 농도. 적절한 풀에서 RNA를 추가합니다.
   메모: 접합 계수 U2AF65는 일반적으로 약 1-10nM의 결합 친화도(평형 해리 상수 또는 K_d)로 모델 인트론의 폴리피리미딘 관/3' 접합 부위에 결합합니다. 그러므로, 결합의 처음 두 라운드는 U2AF65에 대해 K_d보다 10배 높은 단백질 농도를 사용했습니다. SXL 및 PTB 단백질의 경우, 이 범위의 시작 농도는 최선의 추측일 뿐입니다. 이것은 원하는 RNA 종이 결합할 수 있도록 보장했지만 더 낮은 친화성 서열도 잠재적으로 결합되었습니다. 3차 및 4차(전사, 결합 및 증폭)에서 단백질 농도가 3배 감소했습니다. 이것은 친화성이 낮은 RNA 종을 성공적으로 제거하기 위해 수행되었습니다.
2. 결합 반응을 포함하는 튜브를 온도 블록(또는 얼음 위)에 25°C에서 약 30분 동안 놓습니다.
3. 다음 단계를 사용하여 selection-amplification의 처음 4 라운드에 대해 unbound RNA에서 결합된 RNA를 분획합니다.
   1. 진공 매니폴드에 부착된 니트로셀룰로오스 필터를 통해 실온에서 샘플(100μL)을 필터링합니다.
      메모: RNA-단백질 복합체는 유지되지만 결합되지 않은 RNA는 필터에 남아 있지 않습니다.
   2. RNA가 잔류된 필터를 멸균 면도날로 조각으로 자릅니다. 이를 원심분리기 튜브에 삽입합니다. proteinase K(PK) 완충액에 필터 조각을 담근 상태에서 최소 3시간(또는 밤새) 동안 튜브를 부드럽게 굴려 RNA를 회수합니다.
   3. RNA 샘플을 동일한 부피의 페놀-클로로포름(1:1)과 클로로포름이 있는 곳에서 와류로 분리하여 단백질을 제거합니다. 실온에서 5분 동안 샘플을 고속으로 원심분리하여 매번 수성상을 회수합니다.
   4. 아세트산 나트륨 (0.1 부피 3.0M, pH 5.2) 및 에탄올 (절대 에탄올 2-3 부피, 200 proof)과 혼합합니다. 튜브를 -80°C 냉동고에 30분 동안 그대로 두고 10분 동안 고속으로 원심분리한 다음 세척 및 건조 단계에 따라 DEPC로 처리된 물에 RNA를 용해시킵니다.
4. 다음과 같이 마지막 2 라운드(라운드 5 및 6, 전사, 결합 및 증폭) 동안 결합되지 않은 분획에서 단백질 결합 RNA 분획을 분리합니다. 결합 반응(단계 1.1)에서 단백질 농도를 추가로 3배 줄여 추가 선택 압력을 통해 high-affinity binding sequence를 강화하고 low-affinity sequence를 우선적으로 제거합니다.
   1. 위의 RNA:단백질 결합(단계 1.1) 반응을 설정하기 전에 0.5x TBE 완충액(Tris-Borate-EDTA)에 천연 폴리아크릴아미드 겔(60:1 아크릴아미드:비스-아크릴아미드 비율의 5%)을 사전 캐스팅합니다. 이 겔을 차가운 방(4°C)에서 250V를 15분 동안 적용하여 전기영동합니다.
   2. 위 RNA: 단백질 결합 반응 (단계 1.1)를 이 gel.
      의 다른 우물로 피펫으로 삐죽 메모: 단백질은 -80 °C에서 보관하고 20 mM 4- (2- 하이드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 에탄 술폰산 (HEPES), pH 8.0, 20 % 글리세롤, 0.2 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 0.05 % NP-40 및 1 mM 디티 오 트레이톨 (DTT)에 사용하기 전에 희석한다. 0.5–1.0mM 프로테아제 억제제인 페닐메탄 설포닐 플루오라이드(PMSF)의 첨가는 선택 사항입니다. 결합 반응에서 이 완충액은 약 6%의 글리세롤을 기여하며, 이를 통해 별도의 겔 로딩 완충액과 혼합할 필요 없이 샘플을 웰에 직접 적재할 수 있습니다.
   3. 1-2시간 동안 250V의 냉장실(4°C)에서 겔 전기영동을 사용하여 결합되지 않은 RNA에서 결합된 RNA를 분별합니다. 이 공정은 겔 이동성 이동 분석이라고도 합니다.
      참고: 전기영동 지속 시간은 결합에 사용되는 RNA와 단백질의 특징에 따라 다릅니다.
   4. 겔을 X-ray 필름에 노출시키고 자가방사선 촬영을 사용하여 결합된 RNA의 위치를 확인합니다. 결합된 RNA가 있는 겔 슬라이스를 잘라내어 튜브에 삽입합니다.
   5. 분쇄된 겔 슬라이스를 용리에 사용되는 PK 버퍼에 3시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다.
   6. 용출된 RNA 샘플을 먼저 페놀-클로로포름으로 격렬하게 소용돌이치게 한 다음 클로로포름으로 소용
   돌이칩니다.
   7. 아세트산 나트륨과 에탄올을 클로로포름 추출 후 수성상과 혼합합니다. -80 °C 냉동고에서 배양한 후 4 °C에서 5-10분 동안 회전하여 RNA 펠릿을 수집합니다. RNA 펠릿을 에탄올로 세척하고 튜브의 뚜껑을 열어 자연 건조시킵니다. DEPC.
      로 처리된 물에 RNA를 용해시킵니다. 메모: 분획을 위해 겔 이동성 이동 분석법으로 전환하면 예를 들어 분획을 위한 초기 라운드에 사용된 니트로셀룰로오스 필터(또는 모든 매트릭스)에 결합하기 위해 농축되었을 수 있는 원치 않는 RNA 종을 제거할 수 있습니다.

2. 역전사 및 PCR 증폭

1. 20 μL 반응(2 μL의 10x RT Buffer, 2 μL의 AMV 역전사 효소, 1 μM 역의 primer, 10 μL의 RNA, RNase inhibitor 옵션)을 60분 동안 배양하여 역전사 효소와 역 프라이머를 사용하여 용해된 RNA에서 cDNA를 합성합니다.
2. 20–25 PCR 사이클을 사용하여 cDNA를 증폭합니다. 1μM DNA 무작위 라이브러리 템플릿, 각 프라이머 1μM, 20mM Tris(pH 8.0), 1.5mM MgCl2, 50mM KCl, 0.1μg/μL 아세틸화 소 혈청 알부민, Taq 중합효소 2개 단위 및 각 dNTP(데옥시구아노신, Deoxyadenosine, Deoxycytidine 및 Deoxythymidine Triphosphate)를 참조하십시오.

3. 전사 및 단백질 결합

1. RNA 합성, 단백질 결합, 단백질 결합 및 결합되지 않은 분획의 분리 과정을 반복합니다.