용액에서 단백질-지질 상호작용을 연구하기 위한 Microscale Thermophoresis

초록

출처: Sparks, R. P. et al., 단백질-지질 상호 작용을 측정하기 위한 마이크로 스케일 열영동 사용.J. Vis. 특급(2022년)

이 비디오는 단백질-지질 상호 작용을 연구하기 위한 미시적 열영동을 보여줍니다. 이 분석은 온도 구배에 반응하여 형광 표지 단백질의 열영동 움직임을 정량화하여 분자 간의 상호 작용을 감지합니다. 형광 분자는 비형광 지질 분자의 다른 농도와 혼합되고, 용액에 있는 분자의 혼합물은 모세관에 적재됩니다. 모세관의 샘플에 온도 구배가 적용되고 온도 구배에서 형광 분자의 움직임이 감지되고 기록됩니다.

프로토콜

1. 재료 준비

1. 인산염 완충 식염수(PBS)를 준비합니다: 137mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM NaH_2PO4 및 2mM KH_2PO4, pH 7.4.
2. NTA-Atto 647 N 염료를 준비합니다. Tween 없이 스톡 NTA-Atto 647 N 염료를 100% DMSO 용액에서 100nM로 PBS로 희석합니다.
3. Vam7-His8 – E. coli에서 융합 단백질로서의 단백질을 발현하고 Ni-NTA 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제합니다.
4. PBS 완충액에서 분석물을 적정합니다. 분석물이 다른 완충액에 있는 경우, 분석물 완충액의 함량이 표지된 단백질과 상호 작용하지 않는 한, 표지된 MST는 DMSO와 같은 분자와의 사소한 완충액 차이에 특별히 민감하지 않습니다.

2. MST 장치 준비

1. 장치 뒷면의 전원 스위치를 켭니다.
2. 제어 소프트웨어를 열고 장치에 연결된 컴퓨터에서 랩톱이 켜져 있고 연결된 상태인지 확인합니다.
3. 이 실험에 대한 형광 및 MST 설정을 입력합니다. MST Before를 3초로, MST를 30초로, Fluorescence recovery (Fluo.)를 설정합니다.1초 후. 측정 초기 형광이 발생하기 전에 오랜 시간이 필요하지 않습니다. MST는 열 유도 후 평형에 도달하는 실제 시간입니다.
4. 모세관 표: 각 모세관 튜브에 대해 타겟(리간드)의 이름, 리간드의 이름(분석물), 타겟의 농도 및 가장 높은 적정 농도를 입력하고 자동 채우기 적정 비율을 사용합니다. 예를 들어, Vam7-His8의 목표 농도에 50nM, 대상 이름에 Vam7-His8, 리간드 이름에 (1,2-dioctanoyl phosphatidic acid) Di-C8 PA를 입력하고, 리간드의 가장 높은 농도를 1:1로 선택하고 슬롯 2-16을 자동 채우기 위해 아래로 드래그합니다.
5. Cap Scan을 실행하여 타겟 단백질의 신호에 따라 적절한 LED(20% LED(사전 설정))를 선택하고 라벨링된 MST에 대해 200 - 2000 형광 단위 사이를 조정합니다. Cap Scan은 균일하고 둥근 종 모양의 피크를 보여줘야 합니다.
6. MST 출력 범위를 선택하고 각각에 대한 값을 입력하여 가장 강력한 바인딩 맞춤을 테스트하고 Start Cap Scan + Measurement를 눌러 다른 값을 스캔하여 테스트 중인 주어진 상호 작용에 대한 최상의 작동 조건을 결정합니다.
7. 분석 소프트웨어를 사용하여 가장 적합한 MST 파워를 측정하고 Tjump를 사용한 열영동에 대한 사전 설정을 수행합니다. 가장 적합한 MST 파워와 비교하여 가장 낮은 농도와 가장 높은 농도 사이의 대부분의 형광 분리에 따라 피팅을 분석하고 반복 시험을 위한 MST 파워를 선택합니다.
8. 첫 번째 실행과 두 번째 실행 사이에 광표백이 발생했는지 여부는 분석 소프트웨어로 이동하여 분석을 전문가 모드로 전환하여 확인합니다. 다음으로, 분석을 위해 thermophoresis 대신 fluorescence를 선택합니다. 전문가 모드를 선택한 다음 광표백을 선택합니다.

3. 라벨링 된 MST 용 샘플 준비

1. Tween 없이 Vam7-His8 용액을 PBS에서 200nM의 농도로 가져옵니다.
2. NTA-Atto 647 염료를 Tween 없이 PBS에서 100nM로 가져옵니다.
3. Vam7-His8 및 NTA-Atto 647 염료를 1:1 부피 비율로 혼합하고 빛을 차단한 실온에서 30분 동안 방치합니다. 섹션 2.5와 같이 표적 단백질의 적절한 농도를 결정합니다(비디오에 설명된 Ni-NTA 염료의 KD 활용에 대한 보충 자료 참조).
4. 약 8,161 x g의 탁상용 원심분리기를 사용하여 암실에서 NTA-Atto 647 N 염료와 단백질을 10분 동안 혼합한 원심분리기
.
5. 단백질이 변성되는 것을 막기 위해 필요한 경우 몇 시간 이내에 재사용할 수 있도록 실험 후 혼합물을 4°C 또는 실험 중 얼음에 보관하십시오.
6. NT 농도 측정기를 사용하여 적정에 필요한 농도 범위를 측정하십시오.
7. Di-C8 PA를 물에서 적절한 최대 농도로 가져옵니다.
8. 이전 단계를 기반으로 PBS 완충액에서 1:1 연속 희석을 사용하여 16개 농도에 대해 분석물을 적정합니다. SPR과 달리 열영동은 완충액 차이에 민감하지 않습니다.

4. 샘플의 MST

1. 장치와 연결된 노트북을 켭니다.
2. 기계 전면의 위쪽 화살표를 누르고 모세관 랙을 밀어냅니다.
3. 위치 1에서 가장 높은 농도로 랙에 캐필러리를 로드합니다.
4. 제어 소프트웨어에서 NTA-Atto 647 N에 해당하는 빨간색 채널을 선택합니다.
5. Table of Capillaries(모세관 표)에 각 캐필러리에 대한 농도, 위치 및 이름 정보를 입력합니다.
6. 20% LED(사전 설정)에서 Start Cap Scan을 눌러 모세관 스캔을 실행하고 LED 강도 설정 또는 리간드(단백질 라벨링)의 농도를 사용하여 200에서 2000 형광 단위 사이를 적절하게 조정합니다.
7. MST 전력 범위를 선택합니다.
8. 캡 스캔 + MST 측정을 시작합니다.
9. 분석 소프트웨어를 사용하여 분석합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Cy5 말레이미드 모노 반응성 염료	GE 헬스케어	PA23031	단백질 라벨링용
GraphPad 프리즘	GraphPad 소프트웨어
모노리스 NT.115 모세혈관(1000회)	나노 템퍼	모-K022	MST용 모세혈관
모놀리식 NT.115 기계	나노 템퍼		대학 장비
NTA-아토 647 N	시그마	2175	His 태그에 대한 레이블
포스파티딜이노시톨 3-포스페이트 diC8 (PI(3)P diC8)	쉴 론	P-3008	결합 실험을 위한 지질

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