표지된 단백질-인지질 소포 상호작용을 연구하기 위한 정량적 유세포 분석

초록

출처: Podoplelova, N. et al., 정량 유세포 분석을 사용하여 형광 표지 단백질과 인공 인지질 미세소포의 상호 작용 분석. J. Vis. 특급 (2022)

이 비디오에서는 정량적 유세포 분석을 사용하여 단백질과 인공 인지질 소포 간의 상호 작용을 보여줍니다. 형광 표지된 단백질이 형광 표지된 인지질 소포에 결합하면 평균 형광 강도가 증가하며, 이러한 증가는 유세포 분석기에 의해 감지됩니다.

프로토콜

1. 유세포 분석에 의한 단백질-지질 상호 작용 검출

1. 운동 결합 실험
   1. Tyrode의 완충액(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0.4 mM NaH₂PO₄, 2.5 mM CaCl₂, 5 mM 포도당, 0.5% BSA, pH 7.4)에서 인지질 소포를 1 μM의 농도와 250 μL의 총 부피로 희석합니다.
   2. 500nM 농도의 1단계의 형광 표지 응고 인자 X(fX-fd)를 1.1.1단계의 인지질 소포와 1:1 비율(최종 소포 농도 0.5μM, fX-fd 농도는 250nM의 fX)로 총 부피 500μL로 혼합합니다.
   3. 500 μL의 혼합 현탁액(낮은 유속으로 분석의 경우 ~20분)을 유세포분석기에 즉시 주입합니다. 낮은 유속을 사용하고 채널 FL2(여기 488nm, 방출 필터 585/42nm)의 임계값이 값 200인지 확인합니다. Table of Materials.
      에서 형광 염료에 대한 채널 FL4(여기 633nm, 방출 필터 660/20)의 평균 형광을 측정합니다. 메모: 오토샘플러가 없는 유세포분석기를 선택하십시오. 이렇게 하면 시료를 측정 셀에 주입하는 과정이 빨라집니다.
   4. 결합의 포화 상태가 달성되면(5분 이내에 형광이 크게 증가하지 않음) Tyrode의 완충액으로 샘플을 20배 빠르게 희석하고 기준선 형광에 도달할 때까지(완전한 해리) 또는 고원에 도달할 때까지(5분 이내에 형광이 크게 감소하지 않음).
      메모: 대조군으로 10μM EDTA를 추가하고 5분 동안 완전한 해리를 모니터링합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Alexa Fluor 647 NHS 에스테르 (숙시니미딜 에스테르)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A37573 (영문	형광 염료
BD 팍스캉토II	BD 생명과학
DiIC16(3) (1,1'-디헥사데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 과염소산염)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	D384	형광 염료
디엠소	시그마 알드리치	D8418
헤페스	시그마 알드리치	H4034-500지
L-α-포스파티딜세린(뇌, 돼지)(나트륨염)	Avanti 극성 지질	840032P
L-α-포스파티딜콜린(뇌, 돼지)	Avanti 극성 지질	840053P
미니 압출기	Avanti 극성 지질	610020-1개
염화칼륨	시그마 알드리치	P9541-500G
염화칼슘, 무수, 분말, ≥97%	시그마 알드리치	C4901-100G
인산나트륨 일염기성	시그마 알드리치	S3139-250G
소금	시그마 알드리치	S3014-500G
염화마그네슘	시그마 알드리치	M8266-100G
소 혈청 알부민	VWR 생명과학 암레스코	AM-O332-0.1
EDTA 디소듐 염	VWR 생명과학 암레스코	AM-O105B-0.1